PEG10在人胃癌组织中的表达及其临床意义

田 山，彭秀兰，詹 娜，曾 智，贾雪梅，董卫国

1.武汉大学人民医院消化内科，湖北 武汉 430060； 2.武汉市第五医院肿瘤一科； 3.武汉大学人民医院病理科

胃癌是消化道发生率最高的肿瘤，而且是世界上死亡人数第二的恶性肿瘤[1-2]。近年来，胃癌的发病率有下降趋势，但全球每年仍有70万例患者死于胃癌[3]。尽管胃癌的治疗方式多样，尤其是靶向治疗效果颇具成效，5年生存率较前有所上升，但晚期胃癌患者往往由于转移而预后较差[4-5]。因此，寻找新的胃癌分子标记物对早期诊断和改善患者预后意义重大[6]。

基因印迹是一种普遍存在的表观遗传学现象，参与基因表达的调控。正常的印迹基因与细胞增殖、分化及胚胎发育等密切相关，而印迹基因甲基化则参与多种肿瘤的发生、发展。印记基因10(paternally expressed gene 10,PEG10)位于人染色体的7q21区域[7-8]，也称为EDR、HB-1、Mar2、MEF3L、Mart2或RGAG3，是一种印记基因。其特征为仅有来自父本的等位基因表达，而来自母本的等位基因沉默。已有研究[9-12]表明，PEG10在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、胆囊癌和肝癌等多种恶性肿瘤中过表达。此外，PEG10是判断肺癌、胆囊癌、肝癌等预后的潜在生物学标志物。然而，目前关于PEG10在胃癌中表达的研究甚少，PEG10的表达与胃癌的临床病理特征及预后的关系尚不明确。因此，本研究旨在探讨PEG10与胃癌的发生及其临床病理特征与预后的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2010年1月至2017年1月武汉大学人民医院手术切除的胃癌组织(84例)及其癌旁组织(距癌边界<2 cm)、正常胃组织标本(10例)，并构建组织芯片。84例胃癌患者中，男55例，女29例，年龄23～84岁，其中<60岁患者48例，≥60岁患者36例。84例胃癌患者均具有完整的临床病理资料及术后随访资料，所有肿瘤患者术前均未接受放疗、化疗及分子靶向治疗。按照2010年WHO胃肠道肿瘤组织学分类标准[13]对胃癌的诊断、分级进行修订，诊断意见统一。

1.2主要试剂及方法PEG10(稀释浓度1∶500)购自Abcam公司，SP试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色剂购自福州迈新生物技术开发有限公司。染色时用磷酸缓冲液代替一抗作为阴性对照，已知阳性组织(胃癌组织)为阳性对照。所有样本均经质量浓度为40 g/L的中性甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm连续切片。武汉爱威尔生物科技有限责任公司提供技术构建组织芯片。免疫组化采用SP法，切片经甲醛及乙醇脱蜡、水化后，用pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液进行抗原热修复，滴加一抗后在37 ℃的水浴锅中孵育1 h，分别加入二抗、三抗后再行DAB显色，苏木素复染细胞核，冲洗晾干后中性树胶封片。

1.3结果判读PEG10阳性为棕黄色，主要位于胞浆和胞膜。采用半定量积分法[14]判断结果，具体操作如下：(1)阳性强度：无色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分；(2)阳性面积：<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，>50%为3分。总分(0～9)=阳性面积×强度，总分0分为不表达，1～3分为弱表达；4～6分为中度表达；7～9分为强表达，将不表达和弱表达(0～3分)定义为阴性，中度和强表达(4～9分)定义为阳性。

1.4统计学处理采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，应用Kaplan-Meier法对胃癌患者的生存时间进行分析，应用Cox回归模型进行胃癌患者的预后因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1PEG10在胃癌及其癌旁组织中的表达在84例胃癌组织中，有63例(75.00%)PEG10阳性表达；对应的84例癌旁组织中，有50例(59.52%)PEG10阳性表达，差异有统计学意义(χ2=4.601,P=0.032)。标本中PEG10着色主要位于胞浆和胞膜，未见细胞核着色。其中，胃癌组织PEG10以强阳性表达为主，而癌旁组织以弱阳性表达及中度阳性表达为主。10例正常胃组织中均无PEG10阳性表达(见图1)。

2.2PEG10与胃癌患者临床病理参数之间的关系在55例伴淋巴结转移的胃癌患者中，46例PEG10阳性表达，而29例不伴淋巴结转移的患者中，17例PEG10阳性表达，差异有统计学意义(χ2=6.115，P=0.013)，表明PEG10的表达与淋巴结转移相关。35例早期胃癌(Ⅰ+Ⅱ)患者中，有21例患者PEG10阳性表达，而在49例中晚期胃癌(Ⅲ+Ⅳ)患者中，42例患者PEG10阳性表达(χ2=7.710，P=0.007)，表明PEG10与肿瘤TNM分期相关。PEG10的表达与性别、年龄、肿瘤类型、分化程度、浸润深度、Lauren’s分型及肿瘤直径无相关性(P>0.05)(见表1)。

2.3PEG10的表达与胃癌患者预后的关系Kaplan-Meier生存分析显示，PEG10阳性表达的胃癌患者3年生存率为70.80%，5年生存率为32.80%，6年生存率为2.70%，中位生存时间(49.00±1.64)个月。PEG10阴性表达的胃癌患者3年生存率为89.60%，5年生存率为53.20%，6年生存率为26.60%，中位生存时间为(63.00±6.75)个月，经Log-rank检验发现，两者差异有统计学意义(χ2=5.516，P=0.019)(见图2)。通过Cox单因素回归分析发现，胃癌患者年龄及PEG10阳性表达是影响患者生存的危险因素(P<0.05)，而Cox多因素回归分析发现，PEG10阳性表达是患者预后不良的独立危险因素(P=0.03)(见表2)。

3 讨论

PEG10是近年来发现的一种印记基因，其功能取决于甲基化水平[15-16]。同时，PEG10也是一种癌基因，参与多种肿瘤的发生与发展[11，17-18]。本研究发现，PEG10在胃癌组织中高表达(强表达为主)，在相应癌旁组织中相对低表达(中度或弱表达为主)，而在正常胃组织中不表达。王凯[19]的一项研究发现，PEG10在胃腺癌组织中强表达，在相应癌旁组织中低表达，而在正常胃组织中不表达，差异有统计学意义，与此次研究的结果一致。王凯等[20]通过RT-PCR法检测PEG10 mRNA表达时，得出其在胃癌组织中高表达，具有促进胃癌细胞生长这一结论。本次研究结果推测，尽管癌旁组织在形态上尚无明显改变，但其分子生物学水平却已发生改变，PEG10表达较正常胃组织上调。因此，我们推测PEG10上调可能是胃癌早期的分子生物学改变的原因。

图1 PEG10在胃癌、癌旁及正常组织中的表达(100×) A：PEG10在胃癌组织中强阳性表达(黄褐色)；B：PEG10在癌旁组织中弱阳性表达(浅黄色)；C：PEG10在正常胃组织中不表达Fig 1 The expression of PEG10 in the gastric cancer tissues, adjacent tissues and normal gastric tissues (100×) A: PEG10 was strongly expressed in the gastric cancer tissues (tan); B: PEG10 was weakly expressed in the adjacent tissues (light yellow); C: PEG10 was hardly expressed in the normal gastric tissues

表1 胃癌组织中PEG10的表达与临床病理因素的相关性Tab 1 Correlation between the expression of PEG10 and clinicopathological factors in gastric cancers 例数/%

表 2 84例胃癌患者预后因素的Cox回归分析Tab 2 Cox regression analysis of 84 cases of gastric cancer

图2 84例胃癌患者Kaplan-Meier生存曲线Fig 2 Kaplan-Meier survival curves in 84 cases of gastric cancer

此次研究还发现，PEG10的表达与胃癌患者淋巴结转移、TNM分期相关。DENG等[11]研究发现，PEG10高表达与肺癌淋巴结转移密切相关。淋巴结转移是影响胃癌患者预后的不良因素，分化程度低、淋巴管浸润和血管浸润均属于淋巴结转移的重要危险因素[21]。淋巴结转移患者PEG10表达的强度明显强于无淋巴结转移者，两者呈正相关，表明PEG10高表达的胃癌更具有恶性的侵袭性，容易发生局部浸润和淋巴结转移，提示PEG10高表达与胃癌的发生、发展和侵袭转移相关。本研究的Kaplan-Meier生存曲线表明，PEG10表达阳性的胃癌患者5年生存率明显低于PEG10阴性患者，且PEG10阳性表达的胃癌患者中位生存期也明显短于阴性表达者，提示PEG10的高表达促进胃癌的侵袭转移，降低胃癌患者的生存率。因此，PEG10阳性表达有可能成为胃癌癌变早期的分子生物学标志物之一，并可作为预测胃癌患者预后的指标之一。

研究[17]发现，PEG10通过抑制肿瘤细胞凋亡而促进肝癌的发生与转移，其表达受促癌因子c-MYC、转录因子E2F及雄激素的调控[11，22-23]。SHYU等[24]研究发现，miR-122通过与PEG10基因的非转录区结合而下调PEG10表达，因而得出PEG10并非诊断肝癌的理想指标，但对肝癌患者预后判断仍具有一定价值这一结论。LIU等[12]认为，PEG10和TSG101阳性表达与胆囊癌的临床病理特征、肿瘤生物学行为及预后不良密切相关。DENG等[11]认为，PEG10通过上调β-catenin、MMP-2及MMP-9表达，抑制E-cadherin表达而促进肺癌的发生、浸润与转移。PENG等[18]发现，PEG10通过ERK/MMP7通路促进胰腺癌的浸润与转移。此外，AKAMATSU等[25]研究发现，PEG10通过促进TGF-β信号通路Snail蛋白的表达而促进前列腺癌的发生。CHEN等[26]研究表明，PEG10可促进滋养层细胞增生，且通过TIMP-1增加滋养层细胞的侵袭性。可见PEG10通过多种途径参与多种肿瘤的发生与发展。由于目前关于PEG10与胃癌相关性的研究甚少，PEG10参与胃癌发生、发展及转移的具体机制尚不明确，仍需进一步的研究加以探讨。

综上所述，PEG10表达上调可能是胃癌早期病变的分子生物学改变，而高表达与胃癌侵袭及转移等恶性行为相关，是胃癌患者预后不良的一个重要因素。

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