3种小鼠肝纤维化模型的建立及评价

鲁智文， 潘晓莉， 宋宇虎

华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科，湖北 武汉 430022

肝纤维化是多种慢性肝病发展的共同病理基础[1]，绝大多数的肝硬化和肝癌患者由肝纤维化发展而来[2]，肝纤维化属于可逆性病变，因此，建立一种合适的肝纤维化动物模型对于研究肝纤维化的发生发展、防治肝硬化和肝癌具有重要意义[3]。本研究旨在建立3种不同机制的小鼠肝纤维化模型，为肝纤维化的研究提供合适的动物模型。

1 材料与方法1.1 材料

SPF级C57/BL6小鼠雄性41只，雌性3只，6～8周龄，体质量18～22 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。饲养于华中科技大学同济医学院实验动物中心。硫代乙酰胺(TAA)及二乙基亚硝胺(DEN)购自日本TCI公司，四氯化碳(CCl4)购自武汉启动子公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胆总管结扎(bile duct ligation, BDL)诱导的小鼠肝纤维化模型：随机选取20只小鼠分为2组，模型组15只，用质量浓度为100 g/L的水合氯醛溶液进行腹腔注射麻醉，开腹后游离胆总管进行双重结扎并离断，缝合腹腔；对照组5只，为假手术组，麻醉开腹后将胆总管游离，缝合腹腔。于4周后处死小鼠。

1.2.2 TAA诱导的小鼠肝纤维化模型：将另20只小鼠分为2组，模型组15只,将150 mg TAA溶于10 ml生理盐水中配成15 mg/ml的溶液，以150 mg/kg的剂量腹腔注射，每周3次，连续8周，并分别于第2周、3周、4周、6周、8周时随机处死小鼠2只；对照组5只，腹腔注射生理盐水。

1.2.3 DEN+CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型：将1雄3雌4只小鼠饲养至10周后合笼，将孕鼠单独分笼，繁殖的小鼠随机分为模型组15只，15 d大的小鼠以25 mg/kg的剂量腹腔注射DEN 1次，29 d时第1次注射质量浓度为100 g/L的CCl4，5 ml/kg，此后每周注射1次，分别于注射的第10周、12周、14周、16周、18周、20周时随机处死模型组动物2只;对照组5只,腹腔注射生理盐水。各组小鼠处死后取肝组织做石蜡包埋及切片,行HE染色及天狼猩红染色，用光学显微镜观察。

2 结果2.1 肝组织病理学检查结果

所有模型的正常对照组小鼠均可见正常肝小叶，无炎性细胞浸润及纤维组织增生。

2.1.1 BDL模型组：第4周时汇管区可见大量小叶间胆管增生及纤维组织增生，形成汇管区-汇管区桥接纤维化，且肝实质内可见片状肝细胞坏死(见图1)。

2.1.2 TAA模型组：第2周时肝小叶形态和结构完整，汇管区和肝实质内散在炎性细胞浸润；第3周时开始出现肝脏纤维组织增生，可见少许纤维间隔，并广泛肝细胞水样变；第4周时纤维间隔增加，并广泛肝细胞水样变；第6周时小叶结构略紊乱，形成桥接纤维化，不完全假小叶形成；第8周时小叶结构紊乱，大量纤维间隔形成，肝硬化更为典型(见图2)。

图1 BDL组小鼠肝组织病理学检查结果(100×)

图2 TAA组小鼠肝组织病理学检查结果(100×)Fig 2 Results of histopathological examination of liver tissue in TAA group (100×)

2.1.3 DEN+CCl4模型组：第10周时假小叶已基本形成；第12周时形成完整的假小叶，肝硬化较为典型；第14周时大体标本可见肝硬化结节形成；第16周时形成肝癌，HE可见正常肝脏结构已被肿瘤组织浸润、破坏，细胞呈巢状排列；多数癌细胞体积大，呈多角形，胞浆丰富，核大深染，可见病理核分裂象，残存肝组织被肿瘤压迫。第18周及20周时肝癌表现更加明显(见图3)。

图3 DEN+CCl4组小鼠肝组织病理学检查结果(100×)Fig 3 Results of histopathological examination of liver tissue in DEN+CCl4 group (100×)

2.2 肝纤维化造模死亡率统计

2.2.1 BDL组：模型组15只小鼠在术后1～3 d死亡6只，术后1周死亡2只，术后2周死亡2只，死亡率为66.7%；对照组小鼠术后1 d死亡1只。分析死亡原因可能为BDL引起的急性肝损伤及手术不耐受所致。

2.2.2 TAA组：模型组15只小鼠在第1次腹腔注射药物后死亡3只，此后再无小鼠死亡，死亡率为20.0%，分析可能为TAA引起的急性肝损伤，小鼠不耐受所致；对照组无小鼠死亡。

2.2.3 DEN+CCl4组：模型组无小鼠死亡，存活率为100%。对照组无小鼠死亡。

3 讨论

各种病因导致肝脏受损，使肝细胞发生坏死、再生，肝脏中纤维组织增生、肝纤维化形成，可进一步发展成肝硬化及肝癌[4]。肝脏在损伤后发生修复时，细胞外基质的合成与降解失衡，导致胶原沉积，纤维结缔组织增生，即为肝纤维化，病情继续发展，则纤维间隔形成，肝小叶结构消失，代之以假小叶，则形成肝硬化，最后可导致肝癌产生[2]。

3种模型诱导肝纤维化产生机制：(1)BDL模型：BDL模型的原理与人的继发性胆源性肝硬化的机制相似，通过形成肝外胆道梗阻，从而引起胆管扩张、胆汁淤积、胆道内压力升高，并可发生肝内胆小管扩张破裂，肝内血管受扩张胆管及胆汁外渗的双重压迫，使肝细胞缺血坏死，纤维组织大量增生，包围肝小叶，最终形成肝硬化[5]。(2)TAA模型：TAA是一种典型的小鼠肝纤维化及肝硬化模型，采用TAA诱导的肝纤维化动物模型在血流动力学、形态学及生化代谢改变等方面均与人肝纤维化极其相似，与病毒性诱发的肝硬化也很相似。TAA可作用在肝细胞DNA、RNA和蛋白合成酶上产生毒性作用，还可诱发肝代谢紊乱，甚至导致肝坏死[6]。前人在造模方法上各有不同，我们在总结前人的基础上进行探索，成功建立了小鼠肝纤维化及肝硬化模型，该模型具有造模周期短(3～6周即可成模)，操作简便，且与口服药物相比，腹腔注射可控制给药剂量，减少个体差异，具有较好的重复性。但TAA药物毒性大，且易挥发，易造成环境污染，操作时需在通风橱内或通风良好的环境中进行，注意个人防护。(3)DEN+CCl4模型：DEN中含有的亚硝胺基团具有很强的中毒剂和诱癌剂的双重作用[7]，文献中多用来诱导小鼠肝癌模型，与人类肝细胞癌较为相似[8]，本实验利用DEN的致癌作用，联合CCl4，CCl4导致实验动物模型肝损伤的最主要原因是氧化应激反应[9]。通过控制CCl4的给药次数，成功建立了小鼠肝硬化及肝癌模型，减少了DEN的给药，大大降低了死亡率，重复性好，拓展了小鼠肝硬化模型的构建方式。

本实验中肝脏组织HE染色及天狼猩红染色可见BDL组第4周时大量纤维组织增生，胆小管大量扩张、增殖，出现假小叶；TAA组第2周时即有明显的肝脏损伤，少量纤维组织增生，第3周可见大量炎性细胞浸润，少量纤维组织增生，第4周时假小叶基本形成，第6周及8周时肝纤维化更为典型；DEN+CCl4组小鼠第10周时假小叶已基本形成，第12周时出现典型的肝硬化表现，第16周时癌变发生，可见病理核分裂象，第18周及20周时癌变更为明显。

本实验成功建立了3种不同机制的小鼠肝纤维化模型，不同模型的肝纤维化程度及特点不同，在具体的研究工作中，要根据实验目的选择合适的动物模型，以达到最佳的实验效果。

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