3种巯基化合物对冷藏条件下凡纳滨对虾的防黑变和保鲜效果

刘蒙娜，刘 媛，马敏怡，刘书成，吉宏武，高 静，郝记明，毛伟杰

（广东海洋大学食品科技学院/广东省水产品加工与安全重点实验室/广东省海洋食品工程技术研发中心/水产品深加工广东普通高校重点实验室，广东 湛江 524088）

凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）又称南美白对虾，是国际上重要的养殖水产品之一，因其营养丰富和肉质细嫩而深受消费者喜爱。凡纳滨对虾在流通、贮藏和加工过程中，如果处理不及时或不合理，虾体在多酚氧化酶（PPO）的作用下极易发生黑变［1］。有研究表明，4℃下贮藏1 d后虾头胸部就会发生黑变现象，25℃下贮藏4 h后虾体腹部就开始出现黑色斑点、8 h后头胸部出现黑变现象［2］。黑变虽然不影响虾的营养价值，但是严重影响其感官品质和商业价值，从而给经销商和加工企业造成一定的经济损失。

为了防止黑变，对虾捕获后通常需要浸泡在黑变抑制剂溶液中一定时间。目前，商业上使用的黑变抑制剂主要是亚硫酸盐或4-己基间苯二酚（4-Hexylresorcinol，4-HR）等，虽然这些化合物的防黑变效果较好，但有研究认为它们对人体健康存在一定的潜在危害，有国家已经禁止将其作为食品添加剂使用［3-4］。因此，开发绿色安全、高效和低廉的对虾黑变抑制剂非常重要。本实验室在前期从凡纳滨对虾头胸部中提取PPO，筛选了3种对PPO具有很好抑制效果的巯基化合物，包括L-半胱氨酸、还原性谷胱甘肽和N-乙酰-L-半胱氨酸［5］。为了进一步探讨这3种巯基化合物对凡纳滨对虾的防黑变效果，本研究以无菌水、亚硫酸钠和4-HR处理为对照，以黑变评分、相对灰度值、感官评价、菌落总数、挥发性盐基氮和pH值等为指标，评价3种巯基化合物对4℃贮藏的凡纳滨对虾的防黑变和保鲜效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试凡纳滨对虾购于湛江市霞山水产批发市场，规格为60～70尾/kg，充氧保活运至实验室。无菌均质袋、封口包装袋购于东莞市明安包装材料有限公司。

试剂：N-乙酰-L-半胱氨酸、L-半胱氨酸、还原性谷胱甘肽、无水亚硫酸钠、4-己基间苯二酚（4-HR），购于广州市齐云生物技术有限公司；挥发性盐基氮（Total volatile basic nitrogen，TVB-N）速测试剂盒，购于厦门斯坦道科学有限公司；氯化钠（分析纯）、PCA培养基，均购于北京陆桥技术股份有限公司。

仪器：挥发性盐基氮测试仪（厦门斯坦道科学有限公司），BM-400HP无菌拍打均质机（上海楚柏实验室设备有限公司），JYL-C020组织匀浆机（九阳股份有限公司），YP20002电子天平（常州市恒正电子仪器有限公司），PHS-25数显pH计（上海精密科学仪器有限公司），Cannon IXUS82数码相机（日本佳能株式会社），FYLYS-50L贮藏箱（北京福意联有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计 试验于2016年12月至2017年4月在广东海洋大学食品科技学院实验楼进行。选取鲜活的、大小均一的凡纳滨对虾，用冰水猝死后，立即用预冷蒸馏水冲洗干净并沥干，随机分成6组，然后分别浸泡于防黑变抑制剂溶液中30 min（虾质量∶溶液体积=1∶2），处理好的样品包装于封口袋中，置于4℃贮藏，贮藏10 d，每隔2 d随机取样，观察对虾的感官特征和品质测试分析。依据国家食品添加剂使用量标准和本课题组前期研究结果，黑变抑制剂处理浓度为3.2 mg/mL，试验设6个处理：（1）无菌水处理组，空白对照；（2）3.2 mg/mL无水硫酸钠处理，阳性对照；（3）3.2 mg/mL 4-HR处理，阳性对照；（4）3.2 mg/mL N-乙酰-L-半胱氨酸处理；（5）3.2 mg/mL L-半胱氨酸处理；（6）3.2 mg/mL还原性谷胱甘肽处理。每个处理约1 kg对虾。每个处理每个贮藏期各项指标测定均为3次重复，每个贮藏期试验共需要12～15尾虾。

1.2.2 黑变评价 分别从各处理4℃贮藏箱中随机取4尾虾置于同一背景的比色板上。黑变评价采用评分法和测试相对灰度值两种方法。黑变评分采用10分法，评分标准见表1。评定小组由6名评价员组成，评价员根据表1的标准对虾体黑变程度进行评分（0～10分）。分数越高，表明黑变越严重，每隔2 d评定1次。

相对灰度值分析参考Encarnacion等［7］的方法。将每个处理样品放置在同一背景及光照强度的地方，用高清数码相机拍照，用ImageJ软件处理图片并进行灰度分析。样品相对灰度变化根据如下公式计算：

表1 凡纳滨对虾黑变评分标准［6］

式中，A为测试样品的真实灰度值，B为对照样品的平均灰度值。相对灰度值越小，说明黑变越严重。

1.2.3 感官评分 分别从各处理4℃贮藏箱中随机取4尾虾置于同一背景的比色板上。感官评分采用9分法，评分标准见表2。评定小组由6名评价员组成，评价员根据表2的标准分别对凡纳滨对虾的肌肉组织、体表色泽和气味进行评分，评价结果取3项得分总和并取均值。评分在0（完全腐败）～9分（极新鲜）之间，6分以下表明样品已不能被接受。每隔2 d评定1次。

1.2.4 菌落总数测定 菌落总数测定参照《食品微生物学检验 菌落总数测定（GB 4789.2-2016）》［9］的方法。分别从各处理4℃贮藏箱中随机取3尾虾，在无菌操作台上取样后不去皮剪碎，称取10 g放入无菌均质袋中并加入90 mL质量分数为0.85%的食盐水，均质机拍打1～2 min，从中取1 mL样品液于试管中，加入0.85%食盐水，制成1∶10、1∶100、1∶1 000的样品稀释液。取1 mL合适稀释度的样品稀释液于制备好的PCA无菌培养皿上，30℃培养72 h，用菌落计数器记数，以1 mL空白稀释液加入无菌培养皿内作空白对照。

表2 凡纳滨对虾感官评分标准［8］

1.2.5 TVB-N测定 TVB-N测定采用快速检测仪和速测试剂盒检测。分别从各处理4℃贮藏箱中随机取2尾虾，将对虾去头去壳并剪碎，称取3 g于烧杯中，加入0.5 mL 1号挥发性盐基氮提取液，均质至肉沫基本变白；再加入16 mL超纯水，均质后于超声波提取仪中处理10 min；取出加入0.5 mL 2号挥发性盐基氮提取液和10 mL超纯水混匀，静置沉淀，上清液即为样品处理液。取0.25 mL样品处理液于比色皿中，加入1.75 mL超纯水和3滴检测液A放入仪器调零，然后加入3滴检测液B，混匀后在37℃水浴处理10 min，生成黄色物质，经过仪器检测，直接获得TVB-N含量（mg/100 g）。

1.2.6 pH值测定 分别从各处理4℃贮藏箱中随机取3尾虾，将对虾去头去壳并剪碎，称取5 g置于锥形瓶中，加入45 mL蒸馏水（煮沸并冷却），均质，静置30 min，离心，用pH计测定上清液的pH值。

采用SPSS（Version 22）进行方差分析和Excel进行作图。

2 结果与分析

2.1 凡纳滨对虾在贮藏期间黑变评价的变化

2.1.1 黑变评分 从图1可以看出，随着贮藏时间的增加，无菌水对照的凡纳滨对虾黑变评分增加最为显著，贮藏6 d黑变评分达到6分，即凡纳滨对虾发生显著黑变。与无菌水对照相比，阳性对照（亚硫酸钠和4-HR）和3种巯基化合物处理均对防止凡纳滨对虾黑变具有显著效果，贮藏10 d黑变评分均未超过最大可接受值。

图1 凡纳滨对虾在4℃贮藏期间的黑变评分

在相同浓度3.2 mg/mL下，3种巯基化合物对凡纳滨对虾的防黑变效果与亚硫酸钠相当。亚硫酸钠是一种应用非常广泛的PPO褐变抑制剂，对虾的PPO也具有很好的抑制效果，从而有效抑制对虾黑变［10］。亚硫酸钠抑制PPO的机制有两个途径：一是亚硫酸钠结合中间产物醌形成硫代醌从而防止黑色素的生成，二是亚硫酸钠直接作用于PPO，使其失活［11］。在我们前期研究中发现，N-乙酰-L-半胱氨酸、L-半胱氨酸和还原性谷胱甘肽对从凡纳滨对虾中提取的PPO具有很好的抑制效果，而且认为巯基化合物对PPO的抑制是竞争性抑制和不可逆抑制两种机制并存［5］。在浓度为0～0.8 mg/mL时，巯基化合物能与酶促反应中间产物醌类结合形成稳定的无色化合物，从而阻断黑色素的形成，同时巯基化合物与醌类的混合物还是PPO的竞争性抑制剂，表现为竞争性抑制；在浓度为0.8～6.4 mg/mL时，巯基化合物能与PPO活性中心的铜离子结合或取代铜离子紧密结合的组氨酸残基使PPO失活，直接对PPO产生抑制作用，表现为不可逆抑制［5］。在本试验中，3种巯基化合物在浓度为3.2 mg/mL时对凡纳滨对虾均具有很好的防黑变效果，可能主要是巯基化合物不可逆地抑制了对虾PPO的缘故。

在相同浓度3.2 mg/mL下，3种巯基化合物对凡纳滨对虾的防黑变效果均显著弱于4-HR。用4-HR处理的凡纳滨对虾在整个贮藏期内黑变评分均低于2分，说明4-HR对凡纳滨对虾体内的PPO具有很好的抑制作用，从而防止对虾黑变。4-HR对PPO的抑制也有两个途径：如果没有底物存在，4-HR能与脱氧PPO相互作用而使其失活；如果底物与4-HR同时存在，由于4-HR与PPO的底物结构类似，4-HR能优先结合到PPO的活性部位，从而抑制PPO活性［12-13］。

图2 凡纳滨对虾在4℃贮藏期间的相对灰度值

2.1.2 相对灰度值 凡纳滨对虾在贮藏过程中黑变的变化，相对灰度值越小，黑变越严重［7］。从图2可以看出，随着贮藏时间的增加，无菌水对照相对灰度值变化最大，贮藏6 d开始出现负值，说明凡纳滨对虾黑变越来越严重；4-HR处理相对灰度值变化较小，说明凡纳滨对虾的黑变程度较小；亚硫酸钠和3种巯基化合物处理相对灰度值的变化相当，但相对于无菌水对照变化程度较小。这与黑变评分的结果一致。从黑变评分和相对灰度值来看，虽然3种巯基化合物对凡纳滨对虾的防黑变效果弱于4-HR，但是与亚硫酸钠相当，可代替亚硫酸钠作为有效的虾类黑变抑制剂。

2.2 凡纳滨对虾在贮藏期间感官评分的变化

由图3可知，随着贮藏时间的增加，各处理组的感官评分均呈下降趋势，这主要是因为凡纳滨对虾死后在微生物和酶的作用下逐渐发生自溶和腐败，使虾体的外观、肌肉组织和气味等感官特征发生了较大变化。贮藏2 d，各处理感官评分均在可接受范围内；贮藏4 d，无菌水对照和4-HR处理的感官评分低于可接受的6分；贮藏6 d，亚硫酸钠、N-乙酰-L-半胱氨酸、L-半胱氨酸和还原性谷胱甘肽处理感官评分也低于可接受的6分；在贮藏后期（8～10 d），3种巯基化合物处理的感官评分均高于无菌水对照和阳性对照。在整个试验贮藏期内，N-乙酰-L-半胱氨酸和还原性谷胱甘肽处理的感官评分比较接近，且高于其他处理，说明它们可能具有保鲜效果和防止凡纳滨对虾黑变的潜力。这主要是因为这两种化合物具有优良的抗氧化作用，其中，N-乙酰-L-半胱氨酸是一种巯基供给体，能够阻止自由基的生成并清除已存在的自由基，从而起到一定的抗氧化作用［14-16］；还原性谷胱甘肽中的活性巯基能使PPO中处于酶活力中心的二价铜离子还原为一价铜离子，从而抑制对虾黑变［17］。

图3 凡纳滨对虾在4℃贮藏期间的感官评分

2.3 凡纳滨对虾在贮藏期间菌落总数的变化

影响凡纳滨对虾品质的另一个重要因素是微生物，对虾富含高蛋白，为微生物提供了有利的生长环境，随着贮藏期的延长微生物大量繁殖，致使对虾腐败变质。初始菌落总数与对虾的生长环境有关，一般来讲，当菌落总数超过6 logCFU/g时，对虾不可食用并失去市场价值［18］。图4显示，无菌水对照菌落总数在贮藏6 d达到6.53（±0.02）logCFU/g，超过上限值；与无菌水对照相比，阳性对照（4-HR和亚硫酸钠）和3种巯基化合物处理组贮藏6 d或8 d菌落总数即达到6 logCFU/g，说明它们并没有表现出较好的抑菌效果。

图4 凡纳滨对虾在4℃贮藏期间的菌落总数

López-Caballero等［19］报道 4-HR 对对虾没有抑菌保鲜效果。另European［20］的研究显示质量分数为0.05%的4-HR对抑制微生物增长不显著。4-HR没有表现出较好的抑菌效果，推测有两方面原因导致：一是4-HR作为黑变抑制剂，一部分结合对虾中PPO使其失活，只剩少剂量4-HR用于抑菌；二是对虾黑变级联反应产生的抑菌化合物，可能由于4-HR抑制对虾黑变的作用减少了抑菌化合物的形成，从而导致微生物快速增长［21-22］。

2.4 凡纳滨对虾在贮藏期间TVB-N含量的变化

TVB-N是动物性食品在腐败过程中由于微生物和酶的作用使蛋白质分解而产生的氨以及胺类等碱性含氮物质。此类物质具有挥发性，其含量越高，表明食品越不新鲜。因此，TVB-N含量是衡量动物性食品品质的重要指标之一［23］。《食品安全国家标准-鲜、冻动物性水产品》（GB 2733-2015）中规定，每100 g海水鱼虾的TVB-N含量不得超过30 mg［24］。本试验供试的新鲜凡纳滨对虾初始TVB-N含量为每100 g 2 mg。从图5可以看出，随着贮藏时间的增加，各处理的TVB-N含量均呈现显著增加趋势；无菌水对照贮藏10 d，凡纳滨对虾TVB-N含量由每100 g 2 mg上升到13.86（±0.32）mg，未超过上限值；4-HR和还原性谷胱甘肽处理贮藏10 d TVB-N含量已超过上限值；亚硫酸钠、N-乙酰-L-半胱氨酸和L-半胱氨酸处理贮藏10 d TVB-N含量均未超过上限值，尤其是N-乙酰-L-半胱氨酸处理虾体的TVB-N含量缓慢上升到每100 g 8.6（±0.51）mg。

图5 凡纳滨对虾在4℃贮藏期间的TVB-N含量

2.5 凡纳滨对虾在贮藏期间pH值的变化

虾体的pH值会随着贮藏时间的增加而增加，主要是在微生物和酶的作用下虾体中的碱性含氮化合物（如氨、TMA等）累积的结果［25］。pH值的增加与虾的可接受性存在一定的相关性：pH值在7.7以下，虾的品质较好；pH值在7.70～7.95之间，虾的品质下降但可接受；pH值大于7.95，虾达到了不可接受品质［26］。由图6可知，凡纳滨对虾初始pH值为7.09，经过浸泡黑变抑制剂后，pH值稍有变化但不显著；随着贮藏时间的增加，各处理组的pH值均呈显著增加趋势。这主要是由于在微生物和酶的作用下，蛋白质降解使部分碱性基团暴露或游离出部分碱性氨基酸等。当贮藏到第10天时，虽然无菌水、4-HR、N-乙酰-L-半胱氨酸和L-半胱氨酸处理组的pH值在7.70～7.95之间，而亚硫酸钠和还原性谷胱甘肽处理组的pH值稍高于7.95，但是各处理组的pH值之间无显著差异。这说明这几种对虾黑变抑制剂不具有保鲜效果，也与前面菌落总数和TVB-N含量的分析结果一致。

图6 凡纳滨对虾在4℃贮藏期间的pH值

3 结论与讨论

本研究分别以无菌水、亚硫酸钠和4-HR处理为对照，评价了N-乙酰-L-半胱氨酸、L-半胱氨酸、还原性谷胱甘肽等3种巯基化合物对4℃贮藏的凡纳滨对虾的防黑变和保鲜效果。结果表明，从黑变评分和相对灰度值的角度分析，3种巯基化合物对凡纳滨对虾均具有一定的防黑变效果，而且与亚硫酸钠效果相当，但弱于4-HR。在研究中发现，随着贮藏时间延长，用4-HR处理的凡纳滨对虾虾壳会逐渐变红，可能是因为4-HR的保鲜效果较差，在贮藏过程中虾壳中的蛋白质逐渐发生降解使虾青素游离出来，而显出红色［27-28］。Martý´Nez-Alvarez 等［29］通过喷洒4-HR来抑制冷藏条件下挪威龙虾（Nephrops norvegicus）黑变，发现结合有机酸或还原剂能够降低a*红值。Montero等［30］研究显示4-HR虽然能够抑制深水粉虾（Parapenaeus longirostris）黑变，并且随4-HR浓度增加抑制效果增强，但是存在红变现象。亚硫酸钠虽对虾黑变有很好的抑制作用，但对人类健康存在一定的潜在危害［3］。而本研究中3种巯基化合物被广泛应用于食品添加剂及医药领域，其抑制对虾黑变主要是通过不可逆抑制作用的方式，且无红变现象。

从菌落总数、TVB-N和pH值的角度分析，3种巯基化合物对凡纳滨对虾的保鲜效果较差。有研究表明，N-乙酰-L-半胱氨酸能够抑制革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性菌生长，但是冷藏的凡纳滨对虾微生物菌落主要是革兰氏阴性菌，因此它对凡纳滨对虾并不具有明显的抑菌效果［31-32］。熊青等［33］研究认为，L- 半胱氨酸对南美白对虾没有抑菌效果，这与本研究结果一致。而还原性谷胱甘肽可能是由于其作为一种非蛋白巯基化合物，以直接或间接的形式参与微生物的生命活动。革兰氏阴性菌（如大肠杆菌）在有氧条件下，还原性谷胱甘肽有保护其细胞免受辐射损害的作用，为微生物的生长提供了有利条件［34］。此外，还原性谷胱甘肽对大肠杆菌DNA的合成也起着重要作用［35］。革兰氏阳性菌（如乳酸链球菌）能直接从细胞外吸收还原性谷胱甘肽参与一些生理活动，促进其生长繁殖［36］。N-乙酰-L-半胱氨酸能够抑制部分微生物的生长，从而延缓TVB-N含量的增加［31］。L-半胱氨酸和还原性谷胱甘肽在贮藏前期具有抑制TVB-N含量增加的作用，但在贮藏后期不能有效抑制TVB-N含量增加。熊青等［33］研究发下，经半胱氨酸处理的南美白对虾初期TVB-N含量为每100 g 4.9 mg，贮藏到第8天时TVB-N含量接近每100 g 30 mg，这与本研究结果一致。因此，3种巯基化合物可代替亚硫酸钠作为有效的虾类黑变抑制剂，但是要同时对虾进行保鲜，必须与其他抑菌物质进行复配。

渠系受益村社作物种植复杂，地亩不连片，作物需水量多少极不均匀，黑河调水频繁，夏秋季严重缺水，地下水和地表水混合使用，供需水矛盾尖锐，给测水量水工作带来极大困难。

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