HLA配型在免疫性血小板输注无效患者中的应用研究

施蔚，杜容

血小板是血液的一种重要的组成部分，具有改善血液系统疾病及相关疾病患者出血症状，及降低出血致死率的重要功效[1-2]。然而血小板输注治疗也并非是无任何局限性的，其临床疗效也无法满足患者的全部意愿。血小板输注无效（PTR）是临床输血治疗当中经常遇到的一项严重问题，也是血小板维持治疗患者的一项最为严重难题，临床上PTR的发生率较高，因此受到临床广泛关注。由血小板同种人类白细胞抗原（HLA）抗体导致的免疫性PTR为PTR的一种最常见类型。免疫性 PTR的最佳解决方法为根据患者的HLA抗体检测结果输注与患者HLA能够相容的血小板，因此HLA抗体的检测方法对于血小板临床输注治疗具有关键性作用[3-4]。本研究比较传统补体依赖微量淋巴细胞毒交叉法与流式细胞血小板交叉法对检测 HLA抗体的价值，并对根据检测结果配型后的血小板输注治疗效果与患者临床症状及血小板计数的相关性与差异性进行分析，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取浙江省诸暨市人民医院2014年1月至2017年1月收治的不同疾病血小板输注超过2次的患者78例，排除非免疫性PTR患者。其中男42例，女36例；年龄18～61岁，平均（41.26±10.06）岁。

1.2 检测方法 全部患者分别采取流式细胞血小板交叉法（Flow-XM）及补体依赖微量淋巴细胞毒交叉法（NIHCDC）检测HLA抗体。使用恒信化学试剂公司出品的淋巴细胞分离试剂；美国Becton Dickinson出品的PE抗人CD3单体克隆抗体、FITC抗人IgG单体克隆抗体。检测设备为美国BD公司出品的FACSCanto-Ⅱ型流式细胞仪，上海精谊仪器设备公司出品的XSY-1倒置荧光显微镜。以Ficoll-Hypaque离心梯度法分离出供应血源的淋巴细胞，按1×PBS对淋巴细胞的数量进行调整后开展后续检测。分离后的淋巴细胞分别行 NIHCDC、Flow-XM检测。以同期在本院接受健康体检的AB型血健康者混合血清设制为阴性对照血清。

NIH-CDC检测，将淋巴细胞的悬合液与对照血清及补体于37℃下共同孵育60min，使用荧光液终止并固定反应，使用荧光倒置显微镜观察结果。

Flow-XM检测，将分离出的淋巴细胞悬合液与预处理的血清充分混匀，于室温条件下孵育15 min，选取适当滴度荧光抗体FITC-抗IgG、PE-抗CD3标记染色、孵育后使用流式细胞仪进行检测。比例为1×105～1.25×105细胞，预处理的受者血清剂量为25 l，读取10000个淋巴细胞。两种检测方法的阳性结果均以阴性对照血清的均值作为判断标准。

1.3 观察指标 比较NIH-CDC、Flow-XM检测HLA的阳性率；将患者最后一次以随机输注ABO同型血小板后的临床效果与NIH-CDC、Flow-XM配型后（取最高阳性结果）输注的效果进比较；同时观察患者治疗前后血小板计数及临床出血症状的变化情况；分析不同配型输注血小板的效果与血小板计数及出血症状的相关性。

1.4 统计方法 采用SPSS20.0统计软件进行处理，计量资料以均数±标准差表示，比较采取 检验；计数资料比较采用2检验；相关性分析采取Spearman等级相关性分析＜0.05为差异有统计学意义。

表1 Flow-XM配型输注前后血小板计数及出血症状发生率比较

2 结果

2.1 HLA抗体阳性率 Flow-XM检测HLA抗体的阳性 73例，准确率为93.59%；NIH-CDC检测阳性65例，准确率为 83.33%。两者准确率差异有统计学意义（2=4.019＜ 0.05）。

2.2 临床效果 Flow-XM 配型后临床有效72例，有效率为92.31%；随机输注临床有效2例，有效率为2.56%。Flow-XM配型临床有效率高于随机输注临床有效率（2=125.972＜ 0.05）。

2.3 血小板计数及临床症状观察 输注后血小板计数显著升高，出血症状发生率显著下降，差异均有统计学意义（＜0.05）。见表1。

2.4 相关性分析 Flow-XM 配型输注的临床有效率与出血症状发生率呈中度正相关（=0.577＜0.05），与血小板计数呈高度负相关（=－0.896＜0.05）。

3 讨论

随着我国经济水平的不断提高，汽车保有量极大增长，建筑生产类项目大量开展，交通伤、坠落伤等外伤发生率的不断升高，同时随着气候、环境、生活习惯等的重大改变，我国出血性疾病的发生率也逐年上升，这就对临床输血治疗提出了更高、更全面的要求。PTR的发生可对患者的临床救治、身体健康与生命安全均构成严重威胁。导致 PTR发生的主要因素有免疫性因素与非免疫性因素[5-8]。非免疫性因素包括血小板质量、弥散型血管内凝血、骨髓移植、发热感染、循环型免疫复合物、脾肿大、自身抗体以及药物相关抗体等。免疫因素包括，HLA抗体、血小板特异性（HPA）抗体、红细胞的相关抗体[9-10]。免疫因素中以HLA抗体最为常见临床发生率约为80%，其次为HPA抗体临床发生率为5%～10%。血小板的细胞膜上存在有HLAA与HLA-B两个位点抗原，另外血小板的特异性糖蛋白的阳性表达于 PTR的发生也具有不容忽视的作用，其中以抗GPIIb/IIIa的自身型抗体为主。

近些年来，流式细胞仪的技术水平与其分析软件均不断完善，单体克隆抗体被广泛研发，改进Flow-XM的检测方法，研发既能够定性也能够定量，既能够实现基因分型也能够实现抗体分析的一项流式细胞检测方法对于 PTR的防治具有重要价值。血小板资源是临床上一种十分宝贵的医疗资源，Flow-XM检测一方面能够提高PTR的治疗效果，另一方面能够有效地节约血小板资源，对于血液、血小板输注治疗均具有不可或缺的价值。

本研究表明，Flow-XM法检测的准确率优于传统的NIH-CDC检测法（＜0.05）。在 Flow-XM 与 NIH-CDC检测结果均呈阴性的样本当中未检测出存在针对供应血源的HLA抗体。Flow-XM与NIH-CDC检测结果均呈阳性的标本，通过对供、受双方HLA分型验证，均存在有针对供方的HLA抗体。Flow-XM阳性但 NIH-CDC呈阴性的血样，在PRA阳性患者的样本中检测存在有针对供方HLA抗原的明确特异性抗体。同时本研究还发现，Flow-XM配型输注的临床有效率与出血症状发生率呈中度正相关（=0.577＜0.05），与血小板计数呈高度负相关（=－0.896＜0.05）。

综上所述，HLA配型在免疫性PTR中的应用具有重要价值，能够有效提高输注疗效，改善出血症状。

参考文献：

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