SetDB1和β-catenin在结直肠癌中的表达及其意义

卢子剑，寇玉伶，郭庆喜，熊小明，孙兴旺

（西南医科大学附属医院病理科，四川泸州 646000）

结直肠癌是常见的发生于结肠部位的消化道恶性肿瘤，近10年来，全球结直肠癌发病率和死亡率水平基本稳定，但占全球恶性肿瘤发病、死亡的比例仍有所增加[1]。结直肠癌的发生、发展是多基因共同作用的结果，其中，组蛋白赖氨酸甲基化在基因的表达调控中发挥着重要的作用。有研究显示，组蛋白赖氨酸甲基化可以介导肿瘤的发生[2]。而大多数组蛋白甲基转移酶在组蛋白的甲基化中扮演了重要的角色，SetDB1（set domain bifurcated 1）是组蛋白甲基转移酶中重要的结构域之一。SetDB1又称为组蛋白H3赖氨酸9甲基转移酶，定位于1q21染色体上，基因长度为50 kbp。SetDB1与HP1（特异性异染色质蛋白）及CAF1（染色质组装因子）相关联形成复合物，HP1-CAF1-SetDB1复合物可以导致K9在H3上发生单甲基化，进而促进H3K9me3的形成，介导肿瘤的发生[3]。国外研究显示，SetDB1在前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌的发生发展中均扮演重要的角色[4-9]。

另有研究表明[10]，结直肠癌细胞的增殖、分化、侵袭、转移等生物学行为依赖多种信号通路转导，如TGF-β、Wnt信号通路等。其中Wnt信号通路备受关注。Wnt信号通路普遍存在于各种动物体内，在胚胎的发育、细胞增殖与分化等过程中有着重要作用，值得注意的是，Wnt/β-catenin通路的激活在结直肠癌的发生发展中也起到了重要的作用[11]。国外研究发现，在非小细胞肺癌中，SetDB1可以通过调控Wnt信号通路中的关键因子APOE、IGFBP4、FZD1、LRP8，从而影响β-catenin在胞浆的聚集和入核，进而加速肿瘤的发生[8]。但是在结直肠癌中SetDB1是否能通过调控β-catenin从而影响肿瘤的发生却鲜有文献报道。因此，本文通过免疫组织化学的方式，检测SetDB1、β-catenin在结直肠癌中的表达并探讨其临床病理特征，以期了解它们在结直肠癌的发生、发展中的可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集西南医科大学附属医院2013年6月至2014年6月期间，接受手术治疗的原发性结直肠癌患者肿瘤组织标本及距肿瘤边缘＞5 cm处的正常肠黏膜组织标本各70例，其中男性32例，女性38例，年龄39～76岁，平均年龄60.6岁。其中淋巴结转移阳性31例，阴性39例；本次标本肿瘤组织类型为腺癌，分化程度按高、中、低分组，分别为23、39、8例；肿瘤组织最长径＜5 cm有39例，最长径≥5 cm有31例。所有的结直肠癌患者术前均未做过术前放化疗及其他抗肿瘤治疗等。患者均知情同意，符合医学伦理学相关规定。

1.2 主要试剂

SetDB1鼠抗人抗体及β-catenin兔抗人抗体分别购自Abcam及Cell Signaling公司；EDTA抗原修复液、DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组化染色

所有标本做常规脱水、透明、石蜡包埋，6 μm厚连续切片，采用EnVision免疫组化染色方法进行SetDB1、β-catenin染色：将石蜡组织切片后置于60℃恒温烤箱烤片3 h，浸于二甲苯脱蜡、酒精浓度梯度脱水，PBS缓冲液洗涤3次，每次5 min；于枸椽酸盐缓冲液(pH 6.0)中高压修复3 min，冷却至室温后，用蒸馏水冲洗2 min；滴加3%的过氧化物酶阻断剂，消除内源性过氧化物酶的活性，避光孵育15 min；蒸馏水冲洗，PBS洗涤3次，各5 min；滴加一抗SetDB1(1∶300)、β-catenin（1∶500），27 ℃孵育60 min；PBS冲洗切片3次，每次3 min；滴加二抗，27℃孵育30 min；用PBS冲洗切片3次，每次3 min；滴加预先准备好的显色剂DAB工作液，显微镜下控制显色，显色完全后，用自来水冲洗，终止显色；流水冲洗5 min；苏木精复染2 min、0.1%稀盐酸分化、饱和碳酸锂反蓝、脱水、透明、封片。

1.4 结果判读

由两位本院主治级别以上病理科医生各自独立进行盲审，采用半定量方法来评定染色情况。Set⁃DB1表达阳性的结果根据阳性细胞比例及着色深度计分，着色深度评分标准按细胞着色评分：无着色0分；淡棕黄色1分；棕黄色2分；棕褐色3分。阳性细胞比例评分标准：无着色为0分；同一显微镜视野下计算阳性细胞数，按其占肿瘤细胞的比例＜30%为1分，30%～70%为2分，＞70%为3分。根据上述两项指标的分数相加分为4个等级：0分，阴性(-)；1～2分，弱阳性(+)；3～ 4分，阳性(++)；5 ～ 6分，强阳性（+++）。我们将“-/+”定义为蛋白低表达，“++/+++”，定义为蛋白高表达。

β-catenin染色结果判读标准按照Maruyama等[12]的方法：细胞膜阳性表达细胞率＞70%为正常表达，胞浆或胞核阳性表达细胞率＞10%为阳性表达。

1.5 统计学处理

使用SPSS 17.0统计学的软件进行分析。计数资料用χ2检验，相关分析采用Pearson相关，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SetDB1蛋白在结直肠癌中的表达

SetDB1蛋白阳性信号为棕黄色颗粒，主要定位于细胞核（图1），成颗粒或者团状分布，偶可见细胞膜和细胞质也有染色。结果显示，结直肠癌组织中SetDB1蛋白阳性表达率97.14%，明显高于癌旁正常组织SetDB1蛋白阳性表达率30%（χ2＝68.13，P ＜0.05），见表1。

表1 结直肠癌组织及癌旁正常黏膜中SetDB1的表达情况

图1 SetDB1蛋白阳性表达（EnVision法染色，×400）

2.2 癌组织中SetDB1蛋白表达与临床病理特性的关系

2.2.1 癌组织分化程度

癌组织全为腺癌，分化程度按照高、中、低分化三个等级进行分组，SetDB1蛋白在癌组织高分化组的表达率为65.21%，中分化组为89.74%，低分化组为50.00%，其中高、中分化组之间及中、低分化组之间的差异有统计学意义（χ2＝8.710，P ＜ 0.05），见表2。结果提示SetDB1可能参与肿瘤组织的分化类型。

表2 癌组织中SetDB1的表达与分化程度的关系

2.2.2 淋巴结转移

所有手术切除癌组织标本肠周淋巴结均仔细清理、寻找，淋巴结总数不少于15枚。结果显示，在31例发生淋巴结转移的患者中，SetDB1高表达率为80.64%，而在39例未发生淋巴结转移的患者中，Set⁃DB1的高表达率为74.36%，差异无统计学意义（χ2＝0.387，P＞0.05）。这表明SetDB1的表达可能与淋巴结转移无关。

2.2.3 其他临床病理特征

SetDB1的表达与肿瘤组织的浸润深度、肿瘤大小、患者年龄和性别均无关（P＞0.05），见表3。

表3 癌组织中SetDB1的表达与临床指标的关系

2.3 β-catenin在结直肠癌中的表达情况

β-catenin蛋白阳性信号仍为棕黄色颗粒，在正常情况下，β-catenin定位于细胞膜；如果Wnt通路被激活从而导致β-catenin发生阳性表达，则β-catenin蛋白信号将阳性表达于细胞浆和细胞核（图2）。β-catenin在结直肠癌组织和正常肠黏膜组织中的浆核阳性表达率分别为84.28%、47.14%，结直肠癌组织的β-catenin阳性表达率明显高于癌旁组织，差异具有统计学意义（χ2＝21.431，P ＜ 0.001），见表4。

表4 结直肠癌组织及癌旁正常黏膜中β-catenin的表达情况

图2 β-catenin蛋白阳性表达（EnVision法，× 400）

2.4 癌组织中β-catenin蛋白表达与临床病理特性的关系

2.4.1 癌组织分化程度

癌组织中高、中、低分化组别β-catenin蛋白阳性表达率分别为52.17%、66.67%、50.00%，其中各组间差异无统计学意义（χ2＝1.643，P ＞ 0.05），见表5。

表5 癌组织中β-catenin的表达与分化程度的关系

2.4.2 淋巴结转移

在42例β-catenin阳性表达癌组织中，其中有淋巴结转移24例。淋巴结转移组中β-catenin蛋白的阳性表达率为77.42%，显著高于无淋巴结转移组中的β-catenin蛋白阳性表达率46.15%，差异具有统计学意义（χ2＝8.159，P ＜ 0.05）。提示β-catenin的阳性表达可能参与肿瘤的侵袭、转移等生物学行为。

2.4.3 其他临床病理特征

β-catenin的阳性表达与肿瘤组织的分化程度、浸润深度、肿瘤大小、患者年龄和性别均无关（P＞0.05），见表6。

表6 结直肠癌β-catenin表达与临床病理因素的关系

2.5 SetDB1与β-catenin相关性分析

癌组织中SetDB1与β-catenin均呈高表达（图3），且 SetDB1与β-catenin表达存在相关性（r＝0.397，P＝0.001），见表7 。

表7 SetDB1与β-catenin相关性分析

图3 免疫组化检测SetDB1和β-catenin在结直肠癌组织及癌旁组织中的表达（EnVision法，×40）

3 讨 论

正常人体组织、细胞的生长受到癌基因和抑癌基因的精确调控。国内外大量研究表明，肿瘤细胞的无限增殖是由于细胞凋亡受到抑制（癌基因被激活或抑癌基因被抑制）的结果[13]。近几年研究表明，-CpG岛发生甲基化是导致抑癌基因低表达的关键因素之一[14]。甲基化是蛋白质和核酸的一种重要修饰，甲基化功能的本质是甲基化机制的建立、维持和去除甲基[15]，早在1975年，Holliday R等[16]就发现胞嘧啶在CpG位点的甲基化可以通过体细胞的分裂进行遗传。甲基化主要包括DNA的甲基化和蛋白质（主要是精氨酸和赖氨酸）的甲基化。组蛋白尾部通过发生甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等共价修饰来组成组蛋白密码，调节着许多生物学事件[17]。

赖氨酸甲基转移酶四大家族中的许多成员与肿瘤的形成有关，赖氨酸甲基转移酶活性缺失或失调可能是导致肿瘤发生的原因[18]。而甲基化是通过甲基转移酶进行催化、维持，因此，组蛋白赖氨酸甲基转移酶在组蛋白的甲基化中扮演着重要的角色[19]，大多数的组蛋白甲基转移酶都含有Set结构域，构成了Set-domain组蛋白甲基化转移酶家族(SET-do⁃main protein methyltransferase family），组蛋白赖氨酸的甲基化几乎全部由Set-domain家族催化执行[19]。

Set-domain分支型1(即SET domain bifurcated 1，SetDB1)是组蛋白赖氨酸N端甲基转移酶家族中的一员，其编码基因位于人类染色体1q21上[20]。Set⁃DB1与特异性异染色质蛋白HP1及染色质组装因子CAF1相关联形成复合物，这种HP1-CAF1-SetDB1复合物可以导致K9在非核小体组蛋白H3上发生单甲基化，从而促进H3K9me3的形成，介导肿瘤的发生[3]。Set结构域蛋白的主要功能是调节细胞相关增殖基因的活性，但是具体机制还不甚明确。有学者发现SetDB1在多种肿瘤细胞株，比如乳腺癌细胞株和肾脏癌细胞株[21]中的表达均有上调。祝顺琴[22]研究表明沉默SetDB1基因后导致神经母细胞瘤生长、增殖受到抑制，下调SetDB1会抑制嘌呤核苷酸的从头合成从而影响肿瘤的增殖和分化，这表明SetDB1对神经母细胞的增殖和分化具有重要的作用。国内外大量研究也证实SetDB1在前列腺癌、肝细胞癌、肾癌、乳腺癌、脑胶质瘤、黑色素瘤等多种肿瘤细胞中呈现高表达，并且可以通过下调SetDB1的表达来影响肿瘤的生长能力。癌症基因组图谱(TCGA)数据库亦显示SetDB1在肿瘤高表达基因的排名中属于最靠前基因之一[23]。因此，目前已经有部分学者将SetDB1基因作为癌基因看待。本研究显示在70例结直肠癌中，SetDB1在癌组中的阳性率（97.14%）较癌旁组（30%）明显增高，说明SetDB1可能对结直肠癌发生发展起到一定的促进作用；本研究另一结果显示，SetDB1的高表达与肿瘤组织的分化程度有关，中、高分化程度的结直肠癌SetDB1阳性率达到了71.42%，提示SetDB1可能还参与肿瘤的组织分化调控。

Wnt信号传导通路作为与胚胎发育及肿瘤发生密切相关的信号通路之一，目前成为近年来的研究热点。Wnt/β-catenin通路包含3部分：细胞外因子Wnt蛋白、胞膜上的卷曲蛋白及受体及胞质内β-catenin蛋白受体、细胞核内转录因子TCF4/Lef[11]。各种原因导致胞外因子Wnt被激活，通过一系列的作用激活胞内的β-catenin蛋白受体，致β-catenin无法被磷酸化从而在胞质内累积，大量游离的β-catenin在胞浆内聚集，入核与TCF4结合形成复合物，启动下游靶基因的异常转录，进而诱发细胞异常增殖、促进肿瘤发生[24-25]。如上所述，Wnt通路中的关键因子β-catenin如果发生突变或失调都有可能诱导癌症的发生[26]。邹慧娟等[27]在结直肠癌患者血清中发现某些因子可以活化Wnt信号通路，活化后的Wnt信号通路可能会通过β-catenin上调细胞增殖相关因子（c-myc和cyclin D1），从而促进结直肠癌细胞的增殖。还有学者通过对结肠癌组织的基因表达谱进行检测，发现在癌组织里Wnt信号通路中调控细胞周期、基因转录的关键因子均呈上调表达，说明Wnt信号通路的激活可能是结直肠癌发生的重要原因之一，也说明Wnt通路可能是结直肠癌演变过程中的重要信号通路之一[28]。本研究结果显示，β-catenin蛋白在癌组中的表达显著高于癌旁组，说明在结直肠癌患者中Wnt/β-catenin可能被激活，笔者推测Wnt/β-catenin通路的激活可能参与结直肠癌的发生发展，并且本研究的另一结果表明，在淋巴结转移组中β-catenin蛋白的高表达率为77.42%，显著高于无淋巴结转移组，因此笔者推测在结直肠癌中，淋巴结是否转移可能与Wnt/β-catenin通路是否激活有关，这与目前木尔扯尔等人的研究相符[29]。

SetDB1和β-catenin的相关性分析结果表明，相关系数r＝0.397，小于0.8，提示在结直肠癌的发生发展过程中，SetDB1和β-catenin两者之间可能还有其他因子的作用。

4 结 论

本研究结果表明，SetDB1和β-catenin在结直肠癌组织中呈现高表达，SetDB1和β-catenin的关联性分析表明两者呈中度相关，结合相关文献及关联性分析结果推测SetDB1和β-catenin的高表达可能会促进结直肠癌的发生和发展，但由于SetDB1和β-catenin的关联性分析表明两者呈中度相关，Set⁃DB1在结直肠癌中是否能够通过某种方式上调β-catenin的表达进而激活Wnt/β-catenin通路还有待进一步研究。

1. 李道娟，李倩，贺宇彤，等.结直肠癌流行病学趋势[J].肿瘤防治研，2015，42(3)：305-310.

2. John McGrath，Patrick Trojer.Targeting histone lysine methylation in cancer[J].Pharmacol Ther，2015，150:1-22.

3. Loyola A，Tagami H，Bonaldi T，et al.The HP1al⁃pha-CAF1-SetDB1-containing complex provides H3K9me1 for Suv39-mediated K9me3 in pericentric het⁃erochromatin[J].EMBO Rep，2009，10(7):769-775.

4. Rodriguez-Paredes M，Martinez de Paz A，Simó-Riu⁃dalbas L，et al.Gene amplification of the histone methyl⁃transferase SETDB1 contributes to human lung tumori⁃genesis[J].Oncogene，2014，33(21):2 807-2 813.

5. Liu L，Kimball S，Liu H，et al.Genetic alterations of his⁃tone lysine methyltransferases and their significance in breast cancer[J].Oncotarget，2015，6(4):2 466-2 482.

6. Sun Y，Wei M，Ren SC，et al.Histone methyltransfer⁃ase SETDB1 is required for prostate cancer cell prolifera⁃tion，migration and invasion[J].Asian J Androl，2014，16(2):319-324.

7. Fei Q，Shang K，Zhang J，et al.Histone methyltransfer⁃ase SETDB1 regulates liver cancer cell growth through methylation of p53[J].Nat Commun，2015，6:8 651.

8. Sun QY，Ding LW，Xiao JF，et al.SETDB1 accelerates tumourigenesis by regulating the WNT signalling path⁃way[J].J Pathol，2015，235(4):559-570.

9. Wong CM，Wei L，Law CT，et al.Up-regulation of histone methyltransferase SETDB1 by multiple mecha⁃nisms in hepatocellular carcinoma promotes cancer metas⁃tasis[J].Hepatology，2016，63(2):474-487.

10. Shadfan A，Hellebust A，Richards-Kortum R，et al.Confocal foveated endomicroscope for the detection of esophageal carcinoma[J].Biomed Opt Express，2015，6(7):2 311-2 324.

11. 王国强，卢震海，方淯靖，等.Wnt/β-catenin信号通路相关因子与结肠癌患者预后的关系[J].广东医学，2012，33(9):1 245-1 248.

12. Maruyama K，Ochiai A，Akimoto S，et al.Cytoplasmic beta-catenin accumulation as a predictor of hematoge⁃nous metastasis in human colorectal cancer[J].Oncology，2000，59(4):302-309.

13. 李娜，高俊岩，刘敏.细胞凋亡和肿瘤的关系研究进展[J].当代医学，2009，15(16):13-14.

14. 元云飞，李锦清，杨祖立，等.肿瘤相关基因过甲基化的研究进展[J].癌症，2002，21(11):1 267-1 277.

15. 王瑞娴，徐建红.基因组DNA甲基化及组蛋白甲基化[J].遗传，2014，3（36）:191-199.

16. Holliday R，Pugh JE.DNA modification mechanisms and gene activity during development[J].Science，1975，187(4173):226-232.

17. 曹仁贤，文格波.组蛋白赖氨酸甲基化研究进展[J].国际病理科学与临床杂志，2006，26(6):519-523.

18. 潘建华，徐克前.组蛋白赖氨酸甲基转移酶与肿瘤[J].生命的化学，2005，25(2):132-134.

19. Zhang L，Deng L，Chen F，et al.Inhibition of histone H3K79 methylation selectively inhibitsproliferation，self-renewal and metastatic potential of breast cancer[J].Oncotarget，2014.5(21):10 665-10 677.

20. Rea S，Eisenhaber F，O'Carroll D，et al.Regulation of chromatin structure by site-specific histone H3 methyl⁃transferases[J].Nature，2000，406(6796):593-599.

21. 周颖，陈萱.沉默SETDB1对肾癌细胞生长的影响及分子机制研究[J].中国临床研究，2016，7（29）:896-899，903.

22. 祝顺琴.组蛋白H3K9甲基化转移酶SETDB1对神经母细胞瘤增殖与分化的调控研究[D].重庆：重庆大学，2014.

23. Chen Y，McGee J，Chen X，et al.Identification of drug⁃gable cancer driver genes amplified across TCGA datasets[J].PLoS One，2014，9(5):98 293.

24.Ghahhari NM，Babashah S.Interplay between microR⁃NAs and WNT/β-catenin signalling pathway regulates epithelial-mesenchymal transition in cancer[J].Eur J Can⁃cer，2015，51(12):1 638-1 649.

25. Thomson S，Petti F，Sujka-Kwok I，et al.A systems view of epithelial-mesenchymal transition signaling states[J].Clin Exp Metastasis，2011，28(2):137-155.

26. Klaus A，Birchmeier W.Wnt signalling and its impact on development and Cancer[J].Nat Rev Cancer，2008，8(5):387-398.

27. 邹慧娟，郑航，李明君，等.Wnt信号通路在结肠癌中的表达及其作用机制[J].中国老年学杂志，2016，14（36）:3 373-3 374.

28. 陈伙辉，汪森明，陈燕武，等.结肠癌患者Wnt信号通路的变化和作用[J].中国实用医药，2009，4（7）:11-12.

29. 木尔扯尔，文彬，黄一凡，等.β-catenin与wisp-1在结肠癌中的表达及意义[J].现代肿瘤医学，2014，2（22）:366-370.