RAPID'Sakazakii Agar克罗诺杆菌属显色培养基的性能评价

张西萌 韩笑 付溥博 曾 静 魏海燕 陈鑫 魏咏新

（北京出入境检验检疫局 北京 100026）

1 前言

克罗诺杆菌属原名阪崎肠杆菌，在自然界中分布广泛，在水、土壤、食品中均可分离出该菌。克罗诺杆菌属能导致严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，并可引起神经系统后遗症和死亡，因该菌感染引起的死亡率高达50%以上[1]。该菌属[2，3]包括1个新组合、4个新种和3个新亚种。新组合为阪崎肠克罗诺杆菌；4个新种分别为苏黎世克罗诺杆菌、丙二酸盐阳性克罗诺杆菌、穆汀斯克罗诺杆菌、都柏林克罗诺杆菌；3个新亚种分别为都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种、都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种、都柏林克罗诺杆菌乳粉亚种。此外还有1个克罗诺杆菌基因种1不是新种，但属于克罗诺杆菌属，即克罗诺杆菌属共有6个种[4]。在目前采用的克罗诺杆菌属检测方法中，传统培养分离法仍是最常用的鉴定方法，而最常见的显色培养基为DFI琼脂，可选择的其他类似培养基并不多见。因此，本研究通过国家标准GB 4789.40方法及伯乐公司研发的新型培养基RSA快速筛选方法对50株克罗诺杆菌属及30株非克罗诺杆菌属进行RAPID'Sakazakii Agar（以下简称RSA）显色培养基鉴定及应用研究。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验菌株

共选取50株目标菌株，其中1株为ATCC 29544标准菌株，其余49株分离株分别来源于奶粉、婴幼儿食品、蛋白粉、黄油、芝士、冰淇淋、面包粉等食品，详见表1。

2.1.2 试剂

RAPID'Sakazakii Agar克罗诺杆菌属显色培养基：RSA 伯乐 2C0010，法国；脑心浸液肉汤：BRAINHEART INFUSION BHI梅里埃 1001221840，法国；克罗诺杆菌属显色培养基：DFI陆桥 121227，国产；缓冲蛋白胨水：Baffer Peptone Water BPW OXIOD 1143896，英国；改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤：Modified Lauryl Sulfate Tryptose Broth mLST陆桥 121128，国产；万古霉素：Vancomycin陆桥130108，国产。

2.1.3 仪器设备

微生物鉴定仪：法国梅里埃 VITEK2 COMPACT30，法国；恒温培养箱（37℃）：MMM FC222，德国；全温振荡器（36℃±1℃）：培英 THZ-C-1，国产；涡旋振荡器：IKA ms3Ds25，德国；McFarland标准比浊仪：梅里埃 DENSICHEK，意大利。

2.2 方法

2.2.1 RSA培养基主要原理

利用克罗诺杆菌属特异性产生α-葡萄糖酶，在此酶的作用下酶底物 5-溴-4氯-3吲哚α-D-甲基葡萄糖苷显示蓝至蓝绿色菌落。44℃培养后脱氧胆酸钠和结晶紫会抑制其他杂菌和干扰菌的生长。

2.2.2 RSA快速筛选培养基选择性研究

2.2.2.1 特异性分析

采用包括ATCC 29544参比菌株在内的49株克罗诺杆菌属针对RSA快速筛选培养基进行特异性研究。

2.2.2.2 交叉反应分析

为了测试该培养基与非克罗诺杆菌属是否存在交叉反应，采用包括肠杆菌科的大肠埃希菌、沙门菌、阴沟肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌等30株非目标菌，同时选取国标法采用的DFI显色培养基与RSA培养基进行交叉反应测试。

2.2.3 RSA快速筛选培养基检测相对准确性研究

2.2.3.1 添加实验

目标菌株：克罗诺杆菌属 ATCC 29544；

干扰菌株：大肠埃希菌为 ATCC 25922；

目标菌添加水平：0=阴性对照，1 600 CFU/100 g样品，120 CFU/100 g；

干扰菌添加水平：2.5×106CFU/100 g样品。

添加方法：将添加菌株在BHI平板上活化，接种单个菌落于 10 mL BHI液体培养基中，36℃150～200 rpm 摇床过夜培养；将培养液用灭菌生理盐水进行梯度稀释，克罗诺杆菌属培养液稀释到10-4和10-5，菌液浓度分别为1 600 CFU/mL和120 CFU/mL；大肠埃希菌菌液添加浓度为2.5×106CFU/mL。分别取1 mL菌液，添加到经高压灭菌的100 g样品中，按照GB 4789.40和RSA快速筛选方法进行检验，添加样品类型主要是乳粉和乳制品。

2.2.3.2 培养条件的影响

培养条件主要是评估关键因素对方法检出率的影响，在此设定的关键因素是培养温度和培养时间。方法：单一菌株的添加；添加方法和添加目标菌株的量：同2.2.3.1；添加基质：经实验证明不含克罗诺杆菌属的婴儿配方奶粉。温度、时间组合为36℃，16 h；36℃，20 h；38℃，16 h；38℃，20 h。每个组合做 2 个平行样品。

2.2.3.3 实际样品的检测

在超市购买50个乳和乳制品样品，样品类别包括3个阶段的婴儿（幼儿）配方奶粉及各种品牌酸奶制品，分别用GB 4789.40和RSA快速筛选方法进行检验。

3 结果

3.1 特异性

RSA快速筛选培养基特异性实验结果见表1。

表1 RSA快速筛选培养基特异性实验结果

表1结果显示：在RSA快速筛选培养基上，ATCC29544参比菌株表现特征性的“蓝绿色”菌落；49株分离株，除BJ-E.sa-56、57表现为蓝色菌落外，其余菌株均表现“蓝绿色”特征菌落；BJ-E.sa-56和57进一步鉴定为克罗诺杆菌属。因此，RSA快速筛选培养基的特异性准确率为96%。

3.2 交叉反应

非目标菌在DFI显色培养基与RSA培养基的测试结果见表2。

表2 30株非目标菌在RSA快速筛选培养基上的菌落特征

表2结果显示：30株非目标菌中一些菌株在RSA培养基上被抑制，不能生长，能生长的菌株多呈紫色和蓝色；在DFI显色培养基上呈白色或者是白的有黑心的菌落。由此结果得出：RSA快速筛选培养基具有非常好的分辨力。

3.3 相对准确性

3.3.1 添加实验

混菌添加实验结果见表3。

表3 混菌添加实验

（续表 3）

表3结果显示：10个不同样品，每个做2个平行样，共计20个样品的测试，在高浓度杂菌干扰的情况下，添加水平为1 600 CFU/100 g样品时，DFI显色培养基的检出率为16/20，即80%；RSA 选择性培养基的检出率为20/20，即100%。添加水平为120 CFU/100 g样品时，DFI显色培养基的检出率为13/20，即65%；RSA 选择性培养基的检出率为20/20，即100%。因此，RSA选择性培养基在高浓度杂菌干扰的情况下，选择性和检出率均优于DFI显色培养基。

3.3.2 培养条件

不同培养温度和培养时间对实验结果的影响见表4。

表4 培养温度和时间对试验结果的影响

表4结果显示：许可范围内，在80 CFU/100 g和20 CFU/100 g添加水平，温度在变化2℃和培养时间变化2 h的情况下，对RSA快速筛选方法的检出率没有影响。

3.3.3 实际样品检测结果

实际样品检测实验中，通过两种检测方法均未检出阳性样品。

4 结论与讨论

克罗诺杆菌属对新生儿危害极大，致死率高达50%以上，因此受到世界各国高度重视。在我国，该项目是国家食品安全标准婴儿配方食品（0-6个月）中必检项目。

Muytjens等[5]研究了克罗诺杆菌属和相关菌株的酶反应特点，研究发现克罗诺杆菌属和其他肠杆菌之间存在主要的不同点：克罗诺杆菌属α-葡萄糖苷酶活性均为阳性，而其他肠杆菌科均为阴性。因此本研究采用的两种显色培养基均利用上述原理，添加了酶底物与之反应，来鉴别克罗诺杆菌属。1985年Farmer等[6]检测了57株克罗诺杆菌属，其中53株α-葡萄糖苷酶活性为阳性。1983年Aldova等[7]评估了从捷克斯洛伐克分离的73株克罗诺杆菌属吐温80脂酶活性，结果显示97.13%的菌株含有该酶。由上述文献记载可以得出，并非全部克罗诺杆菌属都产α-葡萄糖苷酶，因此本研究所采用菌株中2株分离株未显出目标菌蓝绿色菌落，也属正常现象。

本研究通过对50株目标菌及30株非目标菌对克罗诺杆菌属RSA显色培养基进行特异性和交叉性分析、混菌添加、温度条件、实际样品检测等方法进行实验，其中特异性分析实验表明该培养基显示出了良好的分辨力，准确度高达96%以上，其中与其他菌株显色不同的2株分离株来源于同一国家，同一品牌，且这两株分离株的耐药实验显示，在选择的20种抗生素实验中，这两株菌相似度极高，抑菌圈直径基本一致，因此推测这两株具有同源性。交叉性分析实验选取30株非目标菌，包括多株与克罗诺杆菌属近似的革兰阴性肠道菌及部分革兰阳性菌，结果全部菌株都与目标菌颜色有明显差别，易分辨。混菌添加实验和温度实验检出率均为100%，优于同类比对培养基。

微生物检测实验中，培养基的质量优劣将直接影响到检测工作的精准性和可靠性。针对致病菌检测，如能选择一种检出率高于同类产品且易于观察的高品质培养基，对整体实验结果的准确率会有大幅度提高。通过上述5项研究结果充分表明，与传统克罗诺杆菌属显色培养基相比，本次实验所采用的RSA显色培养基具有准确率高、特征性菌落易观察等优点，同时该培养基还具备多项优势：首先操作步骤比传统GB 4789.40方法节省了选择性增菌环节，检测时限缩短1天，其次培养基不需添加任何添加剂，称取量比其他培养基低，从而降低了检测成本。综上所述，RSA显色培养基具有多项同类产品不具备的优点，利于操作及保存，是理想的克罗诺杆菌属检测的培养基。

本研究所采用的RSA培养基显示出良好的分辨力，准确度高达96%以上，干扰菌添加实验和温度实验检出率均为100%，优于同类比对培养基，其可以作为一种选择性培养基在微生物检测行业推广使用。

[1]Joint FAO/WHO workshop on Enterobacter sakazakii and other microorganisms in powderedinfantformula，Geneva，2-5.February 2004 EB/OL.http：//www.who.int/food-safety/micro/meetings/en/report.pdf.

[2]裴晓燕，刘秀梅.阪崎肠杆菌的生物学性状与健康危害[J].中国食品卫生杂志，2004，16（6）：550-555.

[3]NOTIFICATION LIST.Notification that new names and new combinations have appeared in volume 58，part 6，of the IJSEM[A].Int J Systematic and Evolutionary Microbiol，2008，（58）：1995-1996.

[4]赵贵明，袁飞，杨海荣，等.阪崎肠杆菌的分类变化及新种属生物学特性[J]. 卫生研究，2010，39（2）：248-250.

[5]Muytjens H L，van der Rosvan de Repce J，van Druten H A.Enzymatic profiles of Enterobacter sakazakii and relatedspecies with specialreference to the alphaglucosidase reaction and reproducibility of the test system[J].J Clin Micro2biol，1984，20（4）：684-686.

[6]Farmer J J，Davis B R，Hickman Brenner F W，etal.Biochemicalidentification ofnew speciesand biogroupsof Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens[J].J Clin Microbilo，1985，21（1）：46-76.

[7]Aldova E，Hausner O，Postupa R.Tween 2 esterase activity in Enterobacter sakazakii[J].Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg，1983，256（l）：103-108.