银杏叶黄酮成分聚酰胺薄层色谱鉴别方法研究

李洪玉 陶正升 于瑞峰 吴人杰 寿旦

银杏叶为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶。味甘、苦、涩、平, 归心、肺经, 具活血化瘀、通络止痛、敛肺平喘、化浊降脂功效, 临床用于瘀血阻络、胸痹心痛、中风偏瘫、肺虚咳喘、高脂血症［1］。主要活性成分为黄酮类、萜类内酯和多糖等成分［2-4］。银杏叶黄酮类成分的含量测定法有紫外分光光度法［5］和高效液相色谱法等。张鑫等［6］采用自制银杏叶提取物, 测定银杏制剂中槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量, 并与外标法测定结果进行比较, 结果对照提取物测定法与外标法测定结果均具有精密度高, 稳定性、重复性好等优点。杨艳模等［7］以槲皮素为内参物, 建立槲皮素与其他6种黄酮类成分相对校正因子, 计算其他6种成分的含量, 以外标法测定槲皮素, 利用相对校正因子实现对其他6种黄酮类成分含量测定, 实现一测多评。黄琴伟等［8］以银杏叶对照提取物和银杏叶总内酯对照提取物为参照, 确立12个共有峰作为银杏叶制剂的特征峰, 建立了银杏叶片、胶囊和滴丸的特征图谱, 为银杏叶制剂的质量控制提供有效方法。银杏叶黄酮类成分薄层色谱分析常采用硅胶G薄层色谱分析法。贾长英等［9］采用乙酸乙酯预浸提银杏叶粉末, 90%乙醇索氏提取, 点于硅胶G薄层层析板上, 展开剂为氯仿∶甲醇∶甲酸∶水(2.5∶2∶1.5∶1.5), 喷以3%三氯化铝乙醇溶液, 置紫外光灯(365 nm)下检视黄酮成分荧光斑点, 对银杏叶黄酮类成分薄层色谱分析。周继法等［10］选用甲醇为提取溶剂, 水浴加热回流提取银杏叶, 过滤, 滤液作为供试品溶液, 点于硅胶G薄层层析板上, 以正丁醇∶醋酸∶水(4∶1∶5)上层为展开剂, 对银菊口服液中的银杏叶进行定性鉴别。2015版中国药典银杏叶黄酮类成分薄层色谱分析方法采用40%乙醇加热回流提取, 点于用4%醋酸钠溶液制备的硅胶G薄层板上, 以乙酸乙酯∶丁酮∶甲酸∶水(5∶3∶1∶1)为展开剂, 喷以3%三氯化铝乙醇溶液, 置于紫外光灯(365 nm)下检视黄酮荧光斑点。聚酰胺薄层色谱也常用于黄酮类成分分析, 并且具有点量少、展程短、分离效率高等优点。本文采用聚酰胺薄层色谱法用于银杏叶黄酮类成分鉴别, 对银杏叶黄酮类成分的提取条件、展开剂和点样量等进行比较分析, 具体如下。

1 仪器与试药

薄层层析展开缸(120 mm×120 mm);TLC Visualizer型薄层色谱数码成像系统(瑞士卡玛)；XMTD-204型数显恒温水浴锅(上海江星仪器有限公司)；KQ-400DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；20 cm×20 cm聚酰胺薄膜(台州市路桥四甲生化塑料厂)。银杏叶药材(购自广东中药民生堂)；同一棵银杏树的树叶(采自浙江富阳湘溪村)；石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮、甲醇、甲酸、三氯化铝均为分析纯；试验用水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 样品采集 样品1号购自广东中药民生堂的银杏叶药材, 样品为绿色干燥叶。样品2号采自浙江富阳湘溪村银杏树叶, 鲜叶经过阴干得绿色干燥叶。样品3号为上述鲜叶在25℃室温晒干至绿色刚褪去的黄色干燥叶。样品4号采自上述同一棵银杏树的落叶, 为褐色干燥叶。

2.2 银杏叶黄酮类成分提取方法比较

2.2.1 乙醇超声提取 取样品1号银杏叶药材粉末约1 g,精密称定, 加95%乙醇20 ml置100 ml锥形瓶中, 超声提取30 min, 过滤 , 点样。

2.2.2 70%乙醇超声提取 取样品1号粉末约1 g, 精密称定, 加70%乙醇20 ml置100 ml锥形瓶中, 超声提取30 min,过滤, 点样。

2.2.3 50%乙醇超声提取 取样品1号粉末约1 g, 精密称定, 加50%乙醇20 ml置100 ml锥形瓶中, 超声提取30 min,过滤, 点样。

图1 不同乙醇提取浓度薄层色谱图

2.2.4 乙酸乙酯脱酯乙醇超声提取 取样品1号粉末约1 g,精密称定, 加乙酸乙酯20 ml置100 ml锥形瓶中, 超声提取30 min, 滤去乙酸乙酯, 粉末在60℃条件下烘干, 加95%乙醇20 ml, 超声提取30 min, 过滤, 取 5ml滤液置蒸发皿中水浴蒸干, 2 ml乙醇溶解, 点样。

2.2.5 乙醇超声提取正丁醇萃取 取样品1号粉末约1 g,精密称定, 加95%乙醇20 ml置100 ml锥形瓶中, 超声提取30 min, 过滤, 滤液置60 ml分液漏斗中, 加石油醚20 ml萃取1次, 下层加20 ml水饱和的正丁醇萃取1次, 取5 ml正丁醇萃取液置蒸发皿中水浴蒸干, 2 ml乙醇溶解, 点样。

上述五种方法经聚酰胺薄层色谱展开, 置于紫外光灯(365 nm)下检视黄酮荧光斑点, 结果显示2.2.1项下提取方法最好。见图1, 图2。

2.3 聚酰胺薄层色谱展开剂条件比较 采用2.2.1项下的提取方法制备供试品溶液, 进行薄层色谱比较, 分别采用展开剂1∶甲醇；展开剂2∶甲醇∶水(7∶3)；展开剂3∶甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)进行比较。展开距离5 cm；显色剂为3%三氯化铝乙醇溶液, 比较不同展开剂的分离效果。

置于紫外光灯(365 nm)下检视黄酮荧光斑点, 结果显示展开剂3∶甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)分离效果最佳, 明显优于展开剂1∶甲醇和展开剂2∶甲醇∶水(7∶3)。因此,选择甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)为展开剂。见图3, 图4,图5。

2.4 不同点样量的比较 采用2.2.1项下的提取方法制备供试品溶液, 分别以1、3、5 µl为点样量, 以2.3项下的展开剂展开, 展开距离5 cm。点样量3 µl薄层色谱图黄酮成分荧光斑点分离清晰大小适中。见图6。

2.5 不同加工方法银杏叶样品黄酮类成分薄层色谱 取不同加工方法的银杏叶样品, 采用2.2.1项下的提取方法制备供试品溶液, 以2.3项下的展开剂展开, 点样量3 µl, 展开距离5 cm。不同加工方法银杏叶样品薄层色谱黄酮类成分荧光斑点清晰, 分离度和Rf值均较理想。见图7。

图2 不同乙醇提取分离条件薄层色谱图

图3 甲醇展开剂薄层色谱图

图4 甲醇:水展开剂薄层色谱图

图5 甲醇∶丙酮∶水展开剂薄层色谱图

图6 不同点样量的薄层色谱图

图7 不同加工方法银杏叶薄层色谱图

3 讨论

银杏叶粉末黄酮成分中国药典采用40%乙醇加热回流提取, 洪美华等［11］比较热回流提取和超声提取, 结果一致,超声方法简单稳定。本文采用超声提取方法, 同时对5种不同的黄酮成分提取分离条件通过薄层色谱图黄酮成分荧光斑点进行比较, 结果95%乙醇超声提取法效果最好, 95%乙醇超声提取薄层色谱图黄酮成分荧光斑点明显大于正丁醇萃取法和乙酸乙酯脱酯法, 说明乙酸乙酯脱酯和正丁醇萃取过程中黄酮类成分有损失。

聚酰胺薄层色谱不同展开剂甲醇、甲醇∶水(7∶3)和甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)比较：甲醇为展开剂紫外光灯(365 nm)下检视黄酮荧光斑点, 结果显示出黄酮类成分2个主要荧光斑点和2个弱荧光斑点；甲醇∶水(7∶3)为展开剂显示出1个主要荧光斑点和1个弱荧光斑点, 其他黄酮类成分荧光斑点没有分离开；甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)为展开剂显示出4个主要荧光斑点和3个弱荧光斑点。展开剂甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)好于甲醇展开剂和甲醇∶水(7∶3)展开剂。甲醇∶水(7∶3)展开剂中加入丙酮展开剂形成甲醇∶丙酮∶水(3.5∶3.5∶3)展开剂, 展开黄酮类成分的效果好, 可能是丙酮和黄酮类成分的分子结构中都有羰基结构相似相溶, 更易于黄酮类成分的展开。

银杏叶采集加工中国药典规定秋季叶尚绿时采收, 及时干燥, 但没有规定具体干燥方法, 罗实等［12］采用直接烘烤、晒干后烘烤、杀青晾置后烘烤、微波和恒温鼓风5种方法干燥银杏鲜叶, 以银杏叶总黄酮醇苷和总萜类内酯含量为评价指标, 结果恒温鼓风干燥方法最佳。蒋明廉［13］以黄酮类成分为指标采集同一棵树叶比较了鲜叶、生晒叶、阴干叶、冷藏叶、60℃干燥叶和80℃干燥叶, 结果以鲜叶和阴干叶为好。本文采集同一棵银杏树叶, 用阴干和室温干燥的加工方法, 对3种不同颜色银杏树叶黄酮类成分薄层色谱鉴别分析,3种不同颜色银杏树叶均含有黄酮类成分, 若评价其质量还需结合银杏叶总黄酮含量等指标进行综合评价。

［1］ 李金生, 赵琪, 郝勇.国内银杏叶化学成分及制备工艺的研究进展.白求恩医学杂志, 2006, 4(4):220-222.

［2］ 宋唯唯, 刘芬芬, 刘彩红.银杏叶提取物与其黄酮类物质抗氧化作用的比较.泰山医学院学报, 2016, 37(5):484-486.

［3］ 陈梅霞, 苏洁, 张玥莉, 等.银杏叶提取物与银杏黄酮对高脂血症大鼠血脂水平影响的比较研究.中国新药杂志, 2014(7):833-838.

［4］ 张云莎, 杨琳, 庞赓, 等.银杏内酯和银杏黄酮干预β-淀粉样蛋白跨血脑屏障低氧模型转运的体外研究.广东医学, 2016,37(16):2389-2392.

［5］ 王弘, 赵国斌, 刘叔倩.不同产地栽培银杏叶中黄酮类成分的含量测定.中国中药杂志, 2000, 25(7):408-410.

［6］ 张鑫, 张苗苗, 王云霞, 等.对照提取物法测定银杏叶制剂中总黄酮醇苷的含量.中南药学, 2016(8):867-870.

［7］ 杨艳模, 缪建荣, 林海.一测多评法测定银杏叶提取物中7种黄酮类成分含量.中国实验方剂学杂志, 2014, 20(8):82-85.

［8］ 黄琴伟, 赵维良, 严爱娟, 等.对照提取物在银杏叶制剂特征图谱中的应用.医药导报, 2017, 36(7):794-797.

［9］ 贾长英, 唐丽华, 张晓娟, 等.银杏叶黄酮的提取与薄层色谱分离.农业机械, 2013(17):86-89.

［10］ 周继法, 程建明, 马海勇.薄层色谱法鉴别银菊口服液中药材研究.现代医药卫生, 2009, 25(5):655-656.

［11］ 洪美华, 赖珊, 张映娜.薄层色谱法鉴别心舒宁片中银杏叶的主要成分.中国药师, 2007, 10(2):187-188.

［12］ 罗实, 何正有, 姚洁,等.不同干燥方法对银杏叶有效成分的影响.华西药学杂志, 2014, 29(6):678-680.

［13］ 蒋明廉.不同加工方法对银杏叶黄酮甙含量的影响.广西中医药, 2000, 23(6):41-42.