CAPN1基因多态性与鸡生产性状的相关性研究

张增荣 ，蒋小松 ，杨朝武 ，李晴云 ，邱莫寒 ，杜华锐 *

（1.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066；2.四川大恒家禽育种有限公司，四川 成都 610066；3.动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066）

钙蛋白酶Ⅰ（CAPN1）广泛存在于机体各组织，CAPN1是细胞质中主要的蛋白水解酶，肌肉增长和宰后嫩度的变化与蛋白质水解程度密切相关[1]。研究发现，钙蛋白酶系统在肉的嫩化和改善肉质中起着重要作用[2]。Pringle T.D.等[3]研究发现，CAPN1 活性与牛肉嫩度相关。White S.N.等[4]在牛上已发现了与嫩度相关的多态性位点。随着对优质肉鸡的选育，鸡肉嫩度有下降的趋势，而利用分子标记辅助选择将有可能成为现代育种的有力手段。本研究以鸡CAPN1基因为影响肉质的候选基因，利用测序和单链构象多态（SSCP）方法对鸡CAPN1基因外显子10进行SNPs检测，分析金阳丝毛鸡的基因型频率及其不同基因型与生产性能的相关关系，目的在于寻找与嫩度高度相关的遗传标记，为金阳丝毛鸡的分子育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 金阳县畜牧局提供的金阳丝毛鸡，公母各半，共计116只。120日龄时采集血液样品，用酚-氯仿法抽提DNA，然后用TE溶液处理后于-20℃冰箱中保存备用。同时全部屠宰，进行肉质性状测定。

1.2 主要试剂 引物合成由上海英骏生物技术有限公司完成；2×Taq PCR MasterMix购自北京天为时代公司。

1.3 引物设计和PCR扩增 根据CAPN1的DNA序列（GenBank登录号：NC_006090.1），设计鸡 CAPN1基因特异性引物。引物序列为：

PCR扩增总体积为 10 μL，PCR扩增体系的组成：5μL 2×Taq PCR MasterMix，3.6μL ddH2O，上下游引物（10 pmol/μL）各 0.3 μL，0.8 μL 模板 DNA（50ng/μL）。PCR扩增程序：94℃预变性 6min；94℃45s，56℃ 45s，72℃ 1min，35 个循环；最后 72℃继续延伸8min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 SSCP分析 2μL PCR产物和0.8μL 6×loading buffer混合，并离心，98℃变性10min，迅速插入冰中，使之保持变性状态。采用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶（Acr:Bis=29:1）电泳。10V/cm电泳10～11h后，银染显色。

1.5 测序 经SSCP分析后，取2个不同基因型纯合个体的PCR扩增产物在上海英骏生物技术有限公司进行纯化和测序。

1.6 统计分析 计算各种基因型个体在不同品系的分布，用GLM程序进行基因型与肉质性状的最小二乘分析，统计软件用SAS8.1。其基因型效应统计分析模型为：Y=μ+B+S+G+（S×G）+e。其中，Y 为个体肉质性状的观测值，μ为肉质性状的群体均值，B为品系效应，S为性别效应，G为基因型值效应，S×G为性别与基因型的交互作用，e为随机参差效应。

2 结果

2.1 SSCP检测结果 对G5432A位点的PCR产物进行SSCP分析，结果G5432A位点表现出3种基因型：GA、GG、AA。

2.2 不同基因型纯合子个体的测序 各取纯合基因型的片断进行回收，并测序，结果表明：5432位由G→A。G5432A位点GG型的基因序列与GenBank（登录号：NC_006090.1）中的一致，定义为野生型；AA型都定义为突变型；同时该位点的突变都是错义突变，造成Ala突变为Thr。

2.3 金阳丝毛鸡基因型和基因频率统计结果 对金阳丝毛鸡进行基因型检测，计算该基因的基因型频率和基因频率。基因型和基因频率统计结果见表1。分析结果显示：AA基因型高于GG基因型，A等位基因频率也明显高于G等位基因。X2适合性检验表明：G5432A位点在金阳丝毛鸡中未达到Hardy-Weinberg平衡状态（P＜0.05）。

表1 G5432A位点的基因型和基因频率统计

2.4 各种基因型与生产性状的相关研究 采用SAS8.1统计软件，对肉鸡CAPN1基因G5432A位点的3种基因型个体的生产性状进行最小二乘分析，结果发现G5432A位点的3种基因型个体对部分性状有显著影响（P＜0.05），详见表2。GG型个体的活体重、屠体重、初水分、干物质、粗蛋白、粗脂肪、pH值和肌纤维直径均显著高于GA和AA基因型；AA型个体的肌苷酸含量显著高于GA基因型；AA型个体的肌纤维密度显著高于GG基因型。

表2 CAPN1基因G5432A位点不同基因型对肉质性状的影响

3 讨论

3.1 CAPN1基因单碱基突变情况 本试验发现鸡CAPN1基因的第10外显子有一个SNPs位点在8个品系中均具有多态性，并且A等位基因频率为优势等位基因。这个基因位点是错义突变，可能影响转录本空间（二级）结构，以致影响翻译效率，导致蛋白水平改变。经过X2适合性检验，该位点G5432A在金阳丝毛鸡中未达到Hardy-Weinberg平衡状态（P＜0.05）。

3.2 CAPN1基因与肌纤维和屠体性状的遗传效应分析 候选基因法是寻找畜禽QTL的一种非常有效的方法，它可以直接研究具有特定功能基因的多态性与经济性状之间的关系。从本研究结果分析得出，可以将A等位基因作为分子标记用于鸡肉嫩度的辅助选择。

4 结论

CAPN1基因外显子10内的单核苷酸变异会影响肌肉的肌纤维密度、直径、部分屠体重和肉质性状，可以用这个多态性位点对鸡的嫩度进行分子标记辅助选择。CAPN1基因可能是影响鸡肉嫩度的主效基因或与控制这些性状的主效基因连锁。由于本试验所采的样本数量有限，所以还需要进一步的研究验证，也可以采取其他方法进行研究论证。

参考文献：

[1]Hopkins D L，Thompson J M.Inhibition of protease activity Part 1.The effect on tenderness and indicators of proteolysis in ovine muscle[J].Meat Science，2001，59：175-185.

[2]Dorothy E C，George N D.Calcium activated neutral protease（chaplain）system：structure，function，and regulation[J].Physiological Review，1991，71：813-847.

[3]Pringle T D，Sneaky P L，Southern G P，et al.Relationship between skeletal muscle-specific chaplain and tenderness ofconditioned porcine lentissimo muscle[J].Animal Science，1999，77：661-668.

[4]White SN，Casas E，Wheeler TL，et al.A new single nucleotide polymorphism in CAPN1 extends the current tenderness marker test to include cattle of Bos indicus，Bos taurus，and crossbred descent[J].Journal of Animal Science，2005，83（9）：2001-2008.