HPLC法同时测定两种抗宫炎软胶囊中连翘酯苷B和金石蚕苷的含量

★ 吴燕红 许妍 付辉政 钟瑞建

(江西省药品检验检测研究院/江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心 南昌 330029)

抗宫炎软胶囊由广东紫珠干浸膏、乌药干浸膏、益母草干浸膏三味药组成，具有清湿热，止带下的功效。用于因慢性宫颈炎引起的湿热下注，赤白带下，宫颈糜烂，出血等症，有较好的临床疗效。全国有生产企业2家，但2家企业的工艺中所用基质完全不同，一家用水溶性基质聚乙二醇400和聚乙二醇4000，一家用脂溶性基质大豆油。方中广东紫珠干浸膏为君药，具收敛止血，散瘀，清热解毒的功效，主要化学成分为黄酮、苯乙醇苷类、三萜类等，现代药理研究发现[1]，广东紫珠具有止血、镇痛、抑菌、抗炎的作用[2]，其主要药效成分为苯乙醇苷类化合物，2015年版中国药典抗宫炎片含量测定项下即为测定广东紫珠中苯乙醇苷类成分连翘酯苷B和金石蚕苷的含量，因抗宫炎软胶囊现行标准中无君药广东紫珠干浸膏的含量控制项，难以保证临床疗效与稳定，故本研究建立了用同一方法测定两种不同性质的基质制备的抗宫炎软胶囊中连翘酯苷B和金石蚕苷的含量方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 SHIMADZU LC20AD四元低压梯度泵系列，LC solution化学工作站，PDA检测器；Sartorius CP225D电子天平。

1.2 试药 对照品连翘酯苷B(中国食品药品检定研究院,批号:111811-201002);金石蚕苷(中国食品药品检定研究院,批号:111812-201303)。抗宫炎软胶囊(深圳市佳泰药业股份有限公司，批号150124、150322、150716；贵州汇正制药有限责任公司，批号150401、150404、150802、150901、151102)。乙腈为色谱纯(百灵威公司)；水为Milli-Q制备的超纯水；其余试剂为分析纯。

2 实验方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 混合对照品溶液 精密称取连翘酯苷B对照品10.84mg，置50mL量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为连翘酯苷B对照品母液。精密称取金石蚕苷对照品10.32mg，置50mL量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为金石蚕苷对照品母液。分别精密量取上述对照品母液3mL同置25mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液 取装量差异项下的本品内容物，混匀，取约0.5g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入50%甲醇50mL，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性对照溶液 除广东紫珠干浸膏以外，其余药味按抗宫炎软胶囊处方量制成缺广东紫珠干浸膏的阴性对照溶液。

2.2 色谱条件 色谱柱：ThermoHypersil C18；流动相：以乙腈-0.2%磷酸溶液(14∶86)为流动相；流速：0.8mL/min；检测波长：332nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。在上述色谱条件下，样品中连翘酯苷B和金石蚕苷与其他组分的色谱峰分离度良好。色谱图见图1。

3 方法学考察

3.1 线性关系考察 精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液1、2、4、8、10μL，连翘酯苷B和金石蚕苷对照品母液各2、5、10μL，按“2.2”项下色谱条件进样分析，以对照品进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，结果连翘酯苷B回归方程为Y= 1433329.1298X-5573.5482，r= 0.9999，金石蚕苷回归方程为Y=1387854.1119X-5647.8574，r=0.9999，连翘酯苷B在0.02443～2.03575μg之间、金石蚕苷在0.02400～2.00002μg呈良好线性关系。

3.2 精密度试验 精密吸取供试品溶液10 μL，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，依次测定峰面积，计算RSD。结果连翘酯苷B和金石蚕苷峰面积的RSD(n=6)分别为1.3%和1.2%，表明仪器精密度良好。

3.3 稳定性试验 精密吸取供试品溶液10μL，按“2.2”项下色谱条件，在12 h内于0、1、2、4、8、12h分别进样测定，结果连翘酯苷B和金石蚕苷峰面积的RSD(n=6)分别为0.30%、0.33%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

3.4 重复性试验 取同一批抗宫炎软胶囊(深圳市佳泰药业股份有限公司，批号：150716))6份，每份约0.5g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件进样测定，测得连翘酯苷B和金石蚕苷平均含量(n=6)分别为2.9924和2.7002 mg/g，RSD分别为1.8%、1.6%。

3.5 回收率试验 精密称取“3.4”项下已知含量的抗宫炎软胶囊内容物6份，每份约0.25g，精密称定，分别精密加入混合对照品溶液(连翘酯苷B对照品：0.01638 mg/mL ，金石蚕苷对照品：0.01415 mg/mL)50mL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件进样测定，计算回收率。结果连翘酯苷B和金石蚕苷的平均回收率(n=6)分别为103.3%和96.2%，RSD分别为1.5%和0.4%。

3.6 耐用性试验 取同一批抗宫炎软胶囊内容物约0.5g，精密称定，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，分别采用Thermo Hypersil C18(250 mm× 4.6 mm,5 μm)、YMC-Pack ODS-A(250 mm×4.6 mm,5 μm)、InertSustain C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)3种品牌的色谱柱，按“2.2”项下色谱条件进行测定，结果无明显差别，RSD值为1.3%。

4 样品含量测定

分别取收集到的8批抗宫炎软胶囊样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件进行分析，测定峰面积，用外标法计算出连翘酯苷B和金石蚕苷的含量，结果见表1。

1.连翘酯苷B；2金石蚕苷；A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.阴性对照溶液

表1 抗宫炎软胶囊中连翘酯苷B和金石蚕苷含量 mg/mL

5 讨论

5.1 提取方式的考察 因抗宫炎软胶囊制法中两家企业分别使用了水溶性基质聚乙二醇4000、聚乙二醇400和脂溶性基质大豆油，故首先考察基质对两个组分提取效果是否存在干扰。试验选用了甲醇、50%甲醇和稀乙醇，加热回流1h，结果基质在三种提取溶剂中均能很好地溶散，连翘酯苷B和金石蚕苷的含量以50%甲醇提取最高，故确定提取溶剂为50%甲醇。进而固定50%甲醇为溶剂比较了超声40min、加热回流1h对两个组分含量的影响，结果发现超声的方法深圳佳泰药业股份有限公司样品提取液有少量油状物漂浮，而回流的样品基质溶解性较佳，故确定提取方法为加热回流。试验还对加热回流的时间进行了考察，比较了回流30min、1h、1.5h，结果表明两种基质的样品在回流1h和1.5h后，连翘酯苷B和金石蚕苷的含量均无明显差异，最终确定本品的提取方法为50%甲醇加热回流1h。

5.2 规格制定 根据表1测定结果，参考中国药典2015年版抗宫炎胶囊的限度，考虑到软胶囊制备工艺与硬胶囊的差异以及使用基质的影响，按照硬胶囊限度的70%拟定规格(1)(每粒装0.75g，深圳佳泰药业股份有限公司)限度为：每粒含广东紫珠干浸膏以连翘酯苷B(C34H44O19)计，不得少于1.7mg；以金石蚕苷(C35H46O19)计，不得少于0.8mg。规格(2)(每粒装0.65g，贵州光正制药有限责任公司)限度为：每粒含广东紫珠干浸膏以连翘酯苷B(C34H44O19)计，不得少于2.1mg；以金石蚕苷(C35H46O19)计，不得少于1.0mg。参照此限度，8批样品中贵州光正制药有限责任公司5批样品连翘酯苷B均低于限度值，因此为保证临床用药的有效性和可控性，有必要对抗宫炎软胶囊中有效成分连翘酯苷B和金石蚕苷的含量进行控制。

[1]聂韡,朱培林,黄丽莉,等.广东紫珠药材的研究进展[J].中国现代中药,2011,13(9):37-39+44.

[2]蔡灏,孙秀漫, 欧阳彩君,等.HPLC测定不同产地广东紫珠中3种苯乙醇苷的含量[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(10):63-65.