药用辅料苯甲醇细菌内毒素检查方法学研究

陈群英，郑马庆

(1.南京工业大学 江苏省药物研究所，江苏 南京 210009；2.南京工业大学 药学院，江苏 南京 211816)

苯甲醇，英文名为Benzyl alcohol，是医药合成的重要中间体，是最简单的含有苯基的脂肪醇。有微弱的芳香气味，稍溶于水，易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂[1-2]。苯甲醇具有中等抗菌活性，可以抑制革兰氏阳性菌、霉菌和酵母菌。而且具有麻醉、镇痛的功效。因此可以作为药用辅料，应用于药膏或药液中[3]。 苯甲醇收载于FDA《非活性组分指南》(用于注射剂，口服胶囊剂，溶液剂和片剂，局部、阴道用制剂)。在英国准许用于注射与非注射用制剂[4-5]。在应用于注射剂时，有必要对细菌内毒素含量进行测定。本研究依据《中国药典》2015年版第四部“1100生物检查法”项下“1143细菌内毒素检查法”进行干扰试验，建立苯甲醇的细菌内毒素检查方法，并利用凝胶半定量法对样品进行细菌内毒素含量检测。

1 仪器、试剂与药品

1.1 仪器

旋涡振荡器 (VORJEXII)，由海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产；干式恒温器(DC3A)，由南京三爱斯技术开发有限公司生产；电热鼓风干燥箱(DGF30)，南京市实验仪器厂生产；移液器(1000μL、100μL)，Eppendorf。

1.2 药品

苯甲醇，批号100-51-6，纯度99.99%，密度1.047 g/mL，由湖北绿色家园精细化工股份有限公司生产。

1.3 试剂

细菌内毒素工作标准品(WSE)，规格80EU/支，批号150601-201681，由中国药品生物制品检定所生产；细菌内毒素检查用水(BET)，批号1504200，规格5 mL/支，由湛江博康海洋有限公司生产；鲎试剂1(TAL1),规格0.1 mL/支，灵敏度0.125 EU/mL，批号 1503201，由湛江安度斯生物有限公司生产；鲎试剂2(TAL2),规格0.1 mL/支，灵敏度0.125EU/mL，批号1412010，由湛江博康海洋生物有限公司生产。

2 试验方法与结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核

参照《中国药典》2015年版第四部“1100生物检查法”项下“1143细菌内毒素检查法”进行，将两个厂家、两批鲎试剂(标示灵敏度均为0.125EU/mL)进行灵敏度复核试验，结果表明鲎试剂灵敏度符合要求，测定灵敏度均为标示灵敏度。结果见表1。

表1 鲎试剂灵敏度复核试验

2.2 细菌内毒素限值L

根据公式L=K/M，其中K为人用每千克每小时可接受的最大细菌内毒素剂量，其中注射剂为5EU/(kg·h)。M为供试品每千克每小时的最大剂量。根据世界卫生组织规定人体每日摄入苯甲醇最高为5 mg/kg。根据公式计算得苯甲醇内毒素限值L为1EU/mg。

2.3 最大有效稀释倍数MVD

本研究选用灵敏度为0.125EU/mL鲎试剂，根据公式MVD=cL/λ，计算当λ为0.125EU/mL时，液体注射剂c取1，MVD为8000倍。

2.4 干扰试验预实验

取苯甲醇，用细菌内毒素检查用水分别稀释50、100、250、500、1000倍，苯甲醇终浓度分别为20.49、10.47、4.188、2.094、1.047mg/mL，将此系列浓度的溶液记为NPC；用含0.25EU/mL(2λ)的检查用水将苯甲醇稀释50、100、250、500、1000倍，苯甲醇终浓度分别为20.49、10.47、4.188、2.094、1.047mg/mL，且含0.25EU/mL的细菌内毒素，将此系列浓度的溶液记为PPC。

取灵敏度为0.125EU/mL的两个不同厂家的鲎试剂，分别与上述NPC、PPC进行反应，每一浓度重复两管，并设置阳性和阴性对照。结果见表2。

表2 干扰实验预实验

试验结果表明，苯甲醇在稀释至浓度4.188 mg/mL(此时对应苯甲醇稀释倍数为250倍)及以下时，对两个厂家鲎试剂均无抑制作用。

2.5 干扰试验

用细菌内毒素检查用水将苯甲醇稀释成终浓度为2.094mg/mL(稀释500倍)的供试品溶液。用细菌内毒素检查用水(BET)和终浓度为2.094mg/mL的供试品溶液分别将细菌内毒素工作标准品稀释成0.25、0.125、0.06、0.03EU/mL的溶液(分别称为BET系列以及样品系列)，参照《中国药典》2015年版第四部“1100生物检查法”项下“1143细菌内毒素检查法”进行，并设置供试品溶液及BET阴性对照。结果见表3。

表3 干扰试验测定结果(λ=0.125)

试验结果表明，用两种厂家的鲎试剂，Es均为1λ，Et均为1Es，符合中国药典对细菌内毒素检查有效性(0.5λ

2.6 苯甲醇样品检测

采用凝胶半定量实验方法测定。用细菌内毒素检查用水将苯甲醇(批号100-51-6)稀释成终浓度为2.094 mg/mL的供试品溶液。按表4进行检测。

表4 苯甲醇凝胶半定量细菌内毒素检测结果

结果表明，苯甲醇细菌内毒素<0.06EU/mg。

3 讨论

1968年Bang和Levin[6]发现鲎血凝聚机制，并建立用鲎试剂检测细菌内毒素的检测方法,经过世界各国研究人员的不懈努力，利用鲎血检测药品的细菌内毒素得到了广泛的应用和发展。该法具有经济、简便、快速、特异性强及灵敏度高等优点，逐渐取代了传统的家兔热源测试法，现在各国药典已收载了凝胶法和广度法用于细菌内毒素检测[7]。鲎试剂的最适反应pH

值一般为6.0～8.0，过酸或者过碱会对反应起干扰作用。此外，一些干扰因子如脂多糖等也会产生干扰出现假阳性反应[8-9]。因此，在实际的应用中，需排除干扰，进行方法可行性研究。本研究利用逐步稀释法，建立苯甲醇的细菌内毒素检测方法。结果表明，苯甲醇在浓度为10.47 mg/mL及以上时，会对反应起干扰作用，而继续稀释至4.188mg/mL时，干扰消除。为保险起见，选用2.094 mg/mL，进行干扰试验。试验结果表明，苯甲醇在浓度为2.094 mg/mL时对两个厂家的鲎试剂均无干扰作用。利用凝胶半定量法进行苯甲醇内毒素含量测定，测得苯甲醇细菌内毒素小于0.06EU/mg，符合规定。

[1]易 巧,刘旭平,张银花.药用辅料苯甲醇新版药典微生物限度检查适用性试验[J].中国医学创新2017,14(4):48-52.

[2]廖 彬,刘雁鸣,龙海燕,等.气相色谱法测定药用辅料苯甲醇的有关物质[J].中国药师,2015,18(8):1315-1319.

[3]吴鑫干,李陵岚.苯甲醇制造方法[J].工业催化,2002,10(2):26-32.

[4]姚 静.辅料应用指南[M].北京:中国医药科技出版社,2011:157-159.

[5]Raymond C Rowe,Paul J Sheskey,Marian E Quinn.Handbook of Pharmaceutical Excipients [M].6th Edition.London Chicago: the Pharmaceutical press and the American Pharmacists Association,2009: 64-66.

[6]Levin J,Bang F B.Clotlable protein in limulus:its localization and kinetics of its coagulation by endotoxin[J].Thromb Diath Haemorrh,1968,19:186-189.

[7]王 莉,高 华,蔡 彤,等.鲎试剂的研究与应用进展[J].药物分析杂志,2007,27(6):938-942.

[8]国家药典委员会.中华人民共和国药典药典2015年版(四部)[S].北京:中国医药科技出版社,2015:154-157.

[9]王丽华.艾迪注射液细菌内毒素检查方法探讨[J].生物技术通讯,2011,22(6):870-872.

(本文文献格式：陈群英，郑马庆.药用辅料苯甲醇细菌内毒素检查方法学研究[J].山东化工,2018,47(7):68-69,72.)