低频电针对心肌缺血损伤大鼠相关经穴和非相关经穴皮肤温度的影响❋

吴娇娟，程 凯，嵇 波，赵国桢，游 敏，王 丹，严明娜，孙晓敏，白红新，戴 健，路雅雯，刘翼天，葛云鹏，苏 杭

(北京中医药大学,北京 100029)

人体体表穴位、内脏之间存在特定的联系，这种“内属脏腑,外络肢节”的经穴-脏腑相关学说构成了经络学说的核心内容，也成为近年来中医针灸研究的热点。多数研究思路是从穴位到内脏，即刺激体表穴位，监测相关内脏指标，由外而内地研究两者之间的关系，而涉及由内脏指向体表穴位相关性的研究较少，由内而外的逆向论证研究比较薄弱。有研究表明，机体处于同一状态时，相关经穴和非相关经穴在阳性反应[1]、电阻值[2],、红外辐射温度[3]、痛阈值[4]、局部嘌呤物质[5]等方面存在差异，而内脏处于不同状态时相关经穴与非相关经穴的差异性研究较少。本研究借助大鼠心肌缺血模型，探查相关经穴和非相关经穴在大鼠处于不同心肌状态(正常生理态、病理缺血损伤态、低频电针干预态)下体表温度的变化差异，以求证相关经穴对于不同机体状态的反应较非相关经穴是否存在差异及其特异性变化规律。进一步逆向论证经穴-脏腑相关理论，并为其提供实验依据。

1 材料

1.1 动物

40只清洁级Wistar健康品系雄性大鼠，9 周龄，体质量(230±20) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(合格证号SCXK(京)2012-0001)。实验前将动物饲养于室温(24±1)℃、相对湿度(55±5)%的环境中，日光灯照射，12 h 明暗交替，以大鼠普通饲料、自由饮水适应性喂养3 d，排除饮食及环境等可能对动物产生的影响。

1.2 主要试剂、针具和仪器

20%乌拉坦(天津药业焦作有限公司生产，批号 06051121)；青霉素(哈药集团制药总厂生产，批号 CD1408008-1)；针灸针：华佗牌无菌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司)0.20 mm×13 mm；电针仪：二导 HAN’s 穴位刺激仪(LH202H，北京华卫产业开发有限公司)；BL-420E+生物机能实验系统：TM003-0024 成都泰盟科技有限责任公司；呼吸机：成都泰盟软件有限公司 HX-300S 动物呼吸机；冷光源：上海安信光学仪器制造有限公司 LG100-2 医用冷光源；SG-H1 型恒温恒湿实验系统：南京盛光光电医疗仪器有限责任公司；红外热像仪(FLIR SC640,FLIR SYSTEM，美国)；TX51 显微镜：日本 Olympus 公司。

2 方法

2.1 分组

雄性Wistar大鼠40只，按随机数字表法分为5小组，包括空白对照组、假手术组、心肌缺血损伤组(简称模型组)、低频电针内关组(简称低频A组)、低频电针非经非穴组(简称低频B组)。

2.2 造模

造模前大鼠处理:实验前2 d用脱毛膏将心包经“内关”、胃经“足三里”和胆经“阳陵泉”穴区部位的鼠毛脱掉，并洗净残余膏体，再将大鼠放回动物房正常饲养。造模按冠脉结扎法[6]并加以改良制备心肌缺血损伤模型：20%乌拉坦，4.5 mL/kg，腹腔注射麻醉，经口腔行气管插管后连接动物呼吸机(潮气量 80～90 ml；呼吸频率8～10次/min，呼吸比1∶1)，保持呼吸通畅；连接BL-420E+生物机能系统检测心电。于大鼠胸部正中偏左侧备皮，常规消毒，沿第4.5肋间胸骨左缘纵向剪开胸部皮肤及肌肉，暴露肋骨及肋间肌，断开第4.5胸肋连接处，将开睑器纵向放入胸部切口，暂关呼吸机迅速撑开开睑器，再打开呼吸机；在冷光源照射下，用眼科弯镊撕破心包膜，在动脉圆锥和左心耳交界下约2 mm处进行结扎，进针深度约1～1.5 mm，将左冠状静脉和动脉一起结扎，快速排出胸腔气体和液体后逐层缝合，伤口消毒，并在颈部皮下注射青霉素40万U/次/d预防感染。结扎后心肌结扎部位的颜色发绀，心电图J点抬高，初步证明造模成功。剔除结扎前心电图不正常、造模失败及中途死亡的大鼠。以暖光源照射观察，待大鼠呼吸心律稳定撤除呼吸机，术后帮助排痰，注意保暖。

2.3 取穴

根据大鼠形态、解剖生理特点，参考《实验针灸学》[7]穴位标准定位如下。内关：在前肢内侧，距腕关节约3 mm的尺桡骨缝间;足三里：在膝关节后外侧，腓骨小头下约5 mm处;阳陵泉：在足三里上外侧5 mm左右。非经非穴：在环跳穴(后肢髓关节后上缘)外5 mm左右。

2.4 处理方法

空白对照组常规饲养条件下不做任何处理，但在它组电针处理时抓取和固定1次共3 d；假手术组在大鼠冠状动脉左前降支处穿线不结扎，其余操作同模型组；模型组在大鼠冠状动脉左前降支处结扎，形成心肌缺血损伤，其抓取和固定同空白对照组；低频A组造模成功后，用华佗牌规格0.20 mm×13 mm毫针直刺左侧“内关”穴约0.2 cm，在穴位外上方0.5 cm非穴处皮下平刺1 mm，连接电针仪。电针参数设置：频率2 Hz，强度以大鼠前肢微微颤动为度(1mA),20 min,造模后每日处理1次共3 d; 低频B组除电针穴位为非穴外，其余均同经穴A组。

2.5 指标检测

2.5.1 经穴红外热成像检测 仪器设置:温度-40～120℃，热敏感度(FOV)25°× 19°,辐射率:0.98,室温(24±1)℃，相对湿度55%～60%，反射温度20.0 ℃，大气温度25.0 ℃，且在无日光直射环境下相对距离1 m。测试前将大鼠麻醉固定于台架上，置于电热板上保温待测，测试时镜头垂直对准待测腧穴；经穴低频A组、低频B组于第3次电针处理后30 min进行检测，另外3组与治疗组同时进行检测，检测部位为内关、足三里、阳陵泉穴区；记录辐射成像图并用辐射成像处理软件进行分析；通过3个像素点测温合成，像素点间距17 μm，检测范围51 μm；取左、右侧穴区温度的平均值用于数据统计分析。

2.5.2 心肌组织HE染色 穴区皮肤温度检测完成后，开胸取出心脏置于生理盐水中，让其自行收缩排血，大约10 min后用无齿镊轻压心脏排尽余血，并用生理盐水冲洗，再置于4%多聚甲醛液中保存固定。然后将固定好的标本常规脱水、浸蜡、包埋，石蜡切片、脱蜡、苏木素染色、分色，返蓝，伊红染色、脱水、透明、封片，光镜下观察其形态学变化。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠心肌细胞HE染色结果

图1显示，空白对照组心肌细胞排列紧密规则，胞质、胞核显示清晰，细胞膜完整，细胞核居中，未见炎性细胞；假手术组可见心肌细胞少量坏死，心肌纤维呈波浪状改变，存在散在的白细胞浸润；模型组细胞核碎裂、消失，胞质呈不规则粗颗粒状，心肌纤维凝固性坏死并有间质水肿，存在少量中性粒细胞浸润；低频A组心肌细胞排列恢复紧密化，核居中，在缺血坏死区内开始出现增生细胞，炎细胞浸润明显减少；低频B组细胞核碎裂，胞质呈不规则粗颗粒状，心肌纤维凝固性坏死且间质水肿，有少量中性粒细胞浸润。

图1 各组大鼠心肌组织切片(HE染色 ×100)注：A.空白对照组； B.假手术组； C.模型组； D.低频A组； E.低频B组

3.2 不同心肌状态时内关、足三里、阳陵泉穴区的温度变化情况

表1显示，心肌处于缺血损伤态时，相关经穴内关和非相关足三里皮肤温度均降低(P<0.01,P<0.05)，其中内关较足三里明显，而非相关经穴阳陵泉穴的皮肤温度无明显变化。低频电针刺激内关穴3 d后，相关经穴内关穴温度较模型组显著升高(P<0.01)，非相关经穴足三里穴有上升趋势，而非相关经穴阳陵泉穴温度无明显变化。低频电针刺激非经非穴后，内关、足三里、阳陵泉穴穴位温度较模型组均无明显变化。心肌缺血时对比电针干预内关穴和非经非穴状态下，内关和足三里穴温度变化差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。

表1 不同心肌状态时内关、足三里、阳陵泉穴温度变化比较

注：与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较：▲▲P<0.01；与低频A组比较：▇P<0.05，▇ ▇P<0.01

4 讨论

经穴-脏腑相关是经络学说的核心内容之一。早在2000多年前《素问·调经论》就有记载:“五脏之道，皆出于经隧，以行血气，血气不和，百病乃变化而生。”经隧即经脉，强调经脉与五脏的密切联系。《灵枢·海论》云:“夫十二经脉者，内属于府藏，外络于支节”，说明十二经脉的重要功能是沟通脏腑与体表肢节。另《素问·藏气法时论》有:“心病者，胸中痛……膺背肩甲间痛，两臂内痛”，指出脏腑疾病在体表相关经穴会出现反应。近年来，有关经穴脏腑相关的诸多基础和临床研究[8-12]亦从不同侧面肯定了经穴效应特异性的存在.

心肌缺血属于中医学“胸痹”“心痛”“厥心痛”等范畴。根据经脉脏腑相关理论，心包经与此病密切相关。《灵枢·经脉》载有:“主手厥阴心包络之脉……诸邪之在于心者，皆在于心之包络。”而内关为手厥阴之络脉，通阴维脉，可宁心理血，为治疗心胸病要穴，素有“心胸内关谋”之说，其主治病证如《灵枢·经脉》所记载:“心系实则痛，虚则为烦心。”现代临床和实验研究证明[13- 16]，针刺“内关”改善急性心肌缺血疗效确切。

自然界中一切高于绝对零度的物体，都在不断向外发射红外线。研究表明，红外辐射与机体的能量代谢、体热平衡、体温调节及组织结构有着密切联系，温度越高辐射红外线的本领越强[17]。红外热成像诊断技术通过接收人体辐射的红外线，利用映像光学和计算机技术，显示黑白或伪彩色图像[18]。当机体某处发生病理或生理变化时，不同体表结构必将因其血流和代谢变化等产生温度改变，引起红外辐射改变，从而可反映组织不同机体状态。

本研究借助心肌缺血大鼠模型，发现在心肌缺血损伤状态下，心肌细胞存在炎性浸润，相关经穴内关温度明显下降，低频电针内关干预时心肌细胞排列开始恢复，相关经穴内关温度明显升高，非相关经穴足三里和阳陵泉则无此变化。且低频电针非经非穴对各穴区体表温度变化及心肌改善情况不大，表明心肌在不同状态下，相关经穴体表温度较非相关经穴存在一定的变化特征，能反映心肌所处状态，且低频电针内关穴可以改善心肌缺血及其诱发的相关经穴温度下降，其机制尚有待进一步的研究。

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