先天性巨结肠不同节段肠壁神经、平滑肌分布特征及临床价值研究*

莫优炼 杨六成 胡小华 陈茂芳 段立锋 苏嘉鸿 张平锋钟陈 张家德 冯大军

先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease，HD）是小儿常见的先天性肠道疾病之一，发病是由于结肠神经节细胞缺乏引起肠管持续痉挛，进而粪便淤滞结肠近端，长期淤滞使该段结肠肥厚扩张[1-2]。HD临床上常表现为胎便排出障碍、患儿便秘腹胀及营养不良等，HD在很大程度上影响幼儿的生长发育，不利于其正常的学习与生活。本研究通过观察HD不同节段肠壁神经、平滑肌的分布特点，探究HD手术结肠切除范围及术后胃肠功能紊乱的原因，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年1月-2016年12月本院收治的手术切除的46例HD标本，设其为观察组。选取本院同期收治的死于与胃肠道疾病无关的同年龄段的25例患儿的结肠标本，将其设为对照组。（1）纳入标准：观察组参照文献[3]中HD的诊断标准，患儿有HD相关临床症状、经腹部平片和钡剂灌肠等影像学检查及肛门直肠侧压临床诊断为HD；术后病理诊断确诊为HD。两组患儿需有完整的病例资料；家属知情研究，并签署同意书。（2）排除标准：合并有其他肠道疾病、类源性巨结肠者；HD标本无法满足研究要求者。研究具体事项已上报相关部门，医院医学伦理委员会审核通过此研究。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化法 存档蜡块，以肠管纵轴为固定方向，从远端到近端手术切除点每2厘米进行1次取材。（1）SP法：常规脱蜡，采用3%的H2O2在37 ℃条件下孵育10 min左右；之后进行抗原修复，修复时微波温度控制在92～98 ℃，时间为10 min，选择0.01 mol/L的枸橼酸缓冲液（pH=6.0）作为Syn、NCAM抗原修复液；运用正常羊血清工作液封闭，滴入稀释度均为1∶100的兔抗人Syn/NCAM单克隆抗体，4 ℃环境下孵育过夜，PBS缓冲液代替一抗起阴性对照作用。二抗选用抗兔SP试剂盒。DAB/H2O2染色，充分冲洗后再苏木素复染，常规脱水、干燥、封片。（2）苏木素-伊红染色：所有标本同时进行HE染色。

1.3 观察指标 （1）记录两组肌间神经丛、丛内神经节细胞数量。（2）肌层厚度、厚度比：在HE染色后通过低倍镜观察，随机选取10个视野，借助测微尺对环、纵肌的厚度进行测量，并计算厚度比。每小格为10 μm。（3）肌层病变：对肌层的空泡变性程度分为四个等级，无（-）、少量（+）、中等量（++）、大量（+++）。（4）免疫组化染色（Syn、NCAM染色）：用于判断肠壁肌层中阳性着色的神经纤维分布情况。参考文献[4]中相关内容将分布密度分为四等级，阴性（-）：无着色，阳性细胞数不超过10%；弱阳性（+）：黄色，阳性细胞数不超过25%；中度阳性（++）：棕色，阳性细胞数不超过50%；强阳性（+++）：棕褐色，阳性细胞数超过50%。

1.4 统计学处理 所有数据均采用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量资料应用（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，等级资料比较采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患儿的一般资料比较 观察组的患儿年龄1～10个月，平均（4.57±2.26）个月；46例都为短段型、普通型的HD。对照组的患儿年龄1～11个月，平均（4.89±2.02）个月。两组的一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

2.2 HE染色 （1）HE染色后对照组的标本。肠壁结构完整、显示清晰，环肌厚度/纵肌厚度为（1.98±0.13），比值正常，在肌间、黏膜下可见丰富神经丛，丛中同样有丰富神经节细胞。（2）观察组标本形态学变化。①狭窄段：该段神经丛数量少于对照组（P＜0.05）；肌间神经丛中未见神经节细胞，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），且其内的神经纤维增粗、排列异常；在痉挛节段环、纵肌层均增厚（P＜0.05）；两肌层厚度比值为（1.47±0.07），比例失调。②移行段：神经丛内可见神经节细胞，且细胞为幼稚的和少量成熟的；肌层增厚，环、纵肌层厚度比为（1.67±0.79），有肌层空泡样变。③扩张段：肌间神经丛的神经节细胞仍然少于正常对照组，在距该段远端8 cm位置神经节细胞计数基本达到正常水平，与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；在扩张段-0、2、4、6 cm处两肌层厚度均增厚，远端8 cm处两肌层厚度较之前有变薄，但与对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；扩张段各处的环纵比与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。肌层有空泡样变。（3）两组的空泡样程度比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 免疫组化 （1）Syn。对照组的肠段有丰富肌间神经丛；在低倍镜下可见黄褐色染色的小型团块状结构；高倍镜下神经节的胞质呈黄褐色深染状态，在其中有圆形胞核，偶尔可以在腺体处见棕黄色颗粒。在观察组的狭窄段的肌间有神经束，且该束支为Syn阳性增粗状态，未见神经丛内有神经节细胞，与对照组比较，该段增粗的神经干计数多、肌层内神经纤维分布密度高，尤其是环肌层；分析移行段低倍镜下的情况，其神经纤维分布密度高于狭窄段；分析肌层神经纤维在扩张段的分布情况，该段纤维分布密度比对照组高，到距该段远端8 cm处的肌肉与肌间的密度比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。（2）NCAM。肠段的肌内神经丛为NCAM阳性表达的主要区域。胞质为NCAM的定位处，在神经丛中的幼稚的精神节细胞和神经纤维中NCAM呈弱阳性表达。狭窄段肠壁肌间表现为增粗的神经干、肌内神经纤维的NCAM检查分别呈强阳性、阳性。肌间NCAM表达在移行段为中度阳性，可见幼稚神经节细胞胞质深染、胞体小、未见大核仁。在扩张段NCAM在肌间、肌肉神经组织中的表达弱，观察到成熟神经节细胞胞质淡染、核大、可见明显核仁；在距该段远端8 cm处与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。

表1 两组肌间神经丛、神经节细胞、肌层厚度和厚度比比较（±s）

表1 两组肌间神经丛、神经节细胞、肌层厚度和厚度比比较（±s）

注：*P＜0.01、**P＜0.05，除扩张段-8以外，其他节段的肌间神经丛、丛间神经节细胞与对照组比较；各节段的环、纵肌层厚度均大于对照组。

组别 神经丛（个/低倍视野×100）神经节细胞（个/低倍视野×400）环肌层厚度（μm×102/低倍视野）纵肌层厚度（μm×102/低倍视野）环纵厚度比对照组（n=25） 7.66±0.48 5.16±0.41 3.82±0.35 1.93±0.17 1.98±0.13观察组（n=46） 狭窄段 5.37±0.28* 0* 4.05±0.20* 2.94±0.16* 1.47±0.07移行段 4.76±0.29* 1.63±0.73* 7.03±0.20* 4.24±0.17* 1.67±0.79扩张段 -0 5.88±0.25** 3.91±0.34* 10.21±0.14* 4.57±0.11* 2.35±0.69扩张段 -2 6.05±0.26** 4.04±0.17** 12.36±0.19* 4.98±0.13* 2.57±0.08扩张段 -4 6.62±0.23** 4.18±0.35** 11.21±0.13* 5.16±0.26* 2.33±0.06扩张段 -6 7.04±0.24** 4.46±0.39** 11.11±0.13* 4.92±0.13* 2.26±0.06扩张段 -8 7.55±0.23 4.87±0.21 9.81±0.12* 4.66±0.31* 2.18±0.04

表2 两组肌层空泡样变比较 例

3 讨论

HD又称为肠管无神经节细胞症，临床通常表现为肠梗阻的症状[5]。文献[6-9]数据表明，HD在新生儿中的发病率在1/5 000左右，且发病存在性别、种族差异，男性发病多于女性。目前，HD的治疗方式主要为保守和手术治疗，一旦诊断明确、病情加重、术前准备充足则多选择通过巨结肠根治术解除症状[10]。当HD伴发小肠结肠炎时，如果治疗不及时将会危及患儿生命，提高死亡率[11]。目前，HD的术前诊断方式都存在一定局限性，例如不能较好确定病变的性质和范围、不易与HD类缘疾病鉴别等，这些不足很大程度上为HD的诊断增加难度[12]。因此，根治术术前即对直肠黏膜活检标本进行相关标志物的免疫学检测具有重要意义，同时选用特异性的抗体是关键。

Syn是一种存在于突触小泡膜表面的特有蛋白质，能够调节胃肠功能，且功能的发挥与兴奋传导相关[13]。在肠壁神经节细胞、神经纤维中Syn都呈阳性表达，而Syn阳性突触囊泡则随着肠段神经节细胞的变化而变化，其阳性突触囊泡在环、纵肌层中的布局主要显示结肠蠕动功能的分布情况，此外，它还能说明病变部位的肌间、黏膜下的神经丛都发生了病理改变，通常体现为神经递质的异常[14]。NCAM是细胞间黏附因子，在协调神经肌肉的发展中具有显著作用。NCAM在平滑肌细胞增殖时呈高表达，其表达下降主要在细胞突触与神经末梢之间建立成熟联系后[15-16]。研究结果显示，观察组狭窄段的神经丛中MCAM的表达明显强于对照组（弱阳性），且肠神经的异常分布沿着肠段下行而减少，NCAM表达渐趋正常，表明神经、平滑肌细胞分化不完全，影响神经递质在神经肌肉的正常传导，从而导致肠管功能的异常，此时神经组织的未分化成熟程度主要通过NCAM体现。分析HE染色后肠段肌间神经丛中神经节细胞的情况，观察组狭窄段未见该细胞，从移行段开始可见且随着远离该段神经丛及丛中神经节细胞都朝着正常计数恢复，对照组与观察组距扩张段远端8 cm处差异已不明显，这对确定手术切除范围具有参考价值，如果病变部位切除不到位则极有可能导致预后不良、术后复发。研究中观察组肠管均肥厚，尤其以环肌层明显，且环、纵肌层厚度比例失调，尽管在距扩张段远处8 cm处也未恢复正常。在环、纵肌层出现了不同程度的空泡样变，研究表明，空泡样变的形成与炎症、水肿相关，细胞毒素的暴露将加强空泡化。

表3 两组Syn神经纤维分布密度比较 例

表4 两组NCAM神经纤维分布密度比较 例

综上，HD的不同肠段神经、平滑肌的病变情况能够作为根治术切除范围的参考，但合理性仍需进一步研究证实。

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