Wnt-1/β-catenin通路在亚硒酸钠抑制人增生性瘢痕成纤维细胞体外增殖过程中表达研究

杨陆涛 张守忠 潘拥军 曾元临

目前对生物体的演变和发展规律研究已经成为热点，而作为在调控细胞生长、发育和分化过程中起重要作用的Wnt/β-catenin信号通路也得到越来越多的研究。本课题主要研究亚硒酸钠对人增生性瘢痕（Hypertrophic scar，HS）成纤维细胞（Fibroblasts，FB）体外增殖的影响，前期研究已发现亚硒酸钠在体外可以抑制人HSFB的增殖，显示可以明显抑制FB中的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达[1-3]。还没有相关文献显示亚硒酸钠在抑制人HSFB增殖相关机制方面的报道，为了进一步明确亚硒酸钠对人HSFB抑制的分子机制，决定首先从Wnt-1/β-catenin信号通路在亚硒酸钠作用后的人HSFB中的变化方面研究入手，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 取自2016年1-3月在九江市第一人民医院烧伤整形科行HS整形手术的患者瘢痕组织（年龄4～12岁，3例患者的瘢痕组织，其身体健康、近期未使任何抗瘢痕药物、瘢痕组织处于稳定期且无恶变，瘢痕用于研究实验均征得患者家属的知情同意）。设置试验组与和对照组，试验组分为A、B、C、D、E组，每组3份标本，分别加入等量含2.5、5、10、20、40 μmol/L浓度的亚硒酸钠10%胎牛血清的培养基，对照组加入等量的10%胎牛血清培养基（即0 μmol/L浓度的亚硒酸钠）。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂和仪器 亚硒酸钠粉末（Sigma，美国），DMEM（Hyclone，美国），胎牛血清（Hyclone，美 国 ）， 胰 蛋 白 酶（Hyclone， 美 国 ），PBS液（Hyclone，美国），Wnt-1一抗（中杉金桥，北京），β-catenin（中杉金桥，北京），PV-9000试剂盒（中杉金桥，北京），DAB试剂盒（中杉金桥，北京）；CO2恒温培养箱（Thermo-BB15，德国），台式离心机（Allegra，美国），超净工作台（苏干，中国），微量电子秤（上海仪展，中国），倒置显微镜及照相分析系统（CX 40，Olympus，日本），-20 ℃低温冰箱（Siemens，德国）。

1.2.2 FB体外培养 采用林尊文等[2]的改良组织块贴壁结合胰蛋白酶消化法体外培养，将HS剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，经过胰酶消化后再铺于培养瓶底部贴壁，FB从组织块中爬出增生，连续培养后取第4代用于实验研究。

1.2.3 细胞免疫组化法测细胞内Wnt-1、β-catenin蛋白的表达 细胞爬片的制备以及免疫组化实验采用杨陆涛等[1]前期研究细胞免疫组化法检测FB内TGF-β1、Ⅰ、Ⅲ型胶原同样方法。

1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验；组间比较采用单因素多样本均数SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HS组织块培养FB 前3 d未见细胞，第4天可见单个呈梭形状细胞分布于组织块周围，第7天可见较多细胞整齐排列于瘢痕块周围，第15天时细胞基本爬满瓶底，将瘢痕块移出继续培养，瓶底细胞按1∶2传代培养，取第4代用于进一步实验研究。

2.2 细胞免疫组化法检测Wnt-1、β-catenin的表达情况 亚硒酸钠的浓度在0～40 μmol/L，随着浓度的递增，FB的总数在逐渐减少，细胞形状也在发生不同的变化，在40 μmol/L的浓度时FB处于抑制状态，细胞核出现多形性，较多细胞出现核碎裂甚至死亡；随着浓度的递增FB内所表达的Wnt-1和β-catenin蛋白表达的阳性细胞数逐渐减少，阳性率逐渐降低。见表1和图1、2。

表1 各组间各指标免疫组织化学结果分析（±s）

表1 各组间各指标免疫组织化学结果分析（±s）

注：n=3，同一个载玻片中均取3个相对分布均匀的视野便于统计；*与对照组比较，P＜0.05；#与A组比较，P＜0.05；△与B组比较，P＜0.05；○与C组比较，P＜0.05；●与D组比较，P＜0.05。

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图1 不同浓度亚硒酸钠作用后细胞内Wnt-1蛋白变化趋势（免疫组化，×400倍）

图2 不同浓度亚硒酸钠作用后细胞内β-catenin蛋白变化趋势（免疫组化，×400倍）

3 讨论

文献[4-8]的研究显示，Labus和Okuse对小鼠创面模型及FB损伤模型的研究中均发现在创面愈合初期存在Wnt信号的激活，其中Wnt-1表达活跃促进FB的增殖；Sato等[9]观察到HS组织中β-catenin表达量显著高于萎缩性瘢痕组织；Cheon等[10]则观察到β-catenin在HS组织中的表达量与正常手术后瘢痕无明显差异，但其表达持续时间却显著延长，因此还是说明在HS中Wnt信号通路的激活还是很明显的；在最新的研究中Ho等[11]通过外源性干预激活Wnt/β-catenin，发现可以抑制高糖诱发、TGF-β1介导的肾纤维化；在HS或纤维化效应细胞活化的研究中，Caraci等[12]认为TGF-β1可通过ERK途径激活β-catenin，进而促进肺FB的表型转化。上述的研究充分证明，Wnt信号通路在瘢痕的形成和组织的纤维化的过程中起到非常重要的调节作用，其中发挥主要作用的是经典Wnt/β-catenin信号通路，并且β-catenin表达的增加对通路的激活起到关键作用。

人HSFB的本质是由于FB的过度增生，在细胞的增殖的过程中，可能是由于某些代谢产物的刺激，导致细胞的分裂速度过快或者某些信号通路的异常调节，导致细胞周期的异常，在这一点上，人HSFB和肿瘤细胞的异常增殖有一定的相似性。人HS由于组织中FB凋亡减少，继而细胞增殖过度分泌过多的胶原和细胞外基质是导致HS发生的重要机制。细胞凋亡障碍和增殖异常是人HS发生的重要机制之一，但这两者之间并不是相互孤立的。

本实验使用亚硒酸钠抑制人HSFB增殖，探讨Wnt-1/β-catenin信号通路在这个过程中的变化，细胞免疫组化检测结果显示随着亚硒酸钠的浓度升高，Wnt-1蛋白和β-catenin蛋白在FB中的表达均呈现出递减的趋势，同时细胞的数量也表现出逐渐减少的趋势，说明随着亚硒酸钠的浓度增加，可能会促进FB的凋亡和抑制细胞分裂，导致细胞的数量的减少。在HSFB中Wnt-1蛋白和β-catenin蛋白呈现出比正常皮肤中的FB内的Wnt-1蛋白和β-catenin蛋白表达增强的状态，说明在HS形成的过程中，Wnt-1/β-catenin信号通路是一种激活状态，可以促进FB的增殖与分化。而亚硒酸钠中的硒可以明显地抑制FB的增殖与分化，目前单从Wnt-1/β-catenin信号通路的研究中可发现，该条信号通路可以被亚硒酸钠明显的抑制作用，在今后的研究中，可以进一步明确亚硒酸钠是否对其他的信号通路也存在一定程度的抑制作用。

通过本课题的研究可发现硒在瘢痕的抑制方面可起到一定的作用，通过未来对硒在抑制瘢痕的进一步深度研究，可以在临床上对烧伤瘢痕的抑制发挥作用；以及近年来的研究已确证硒在人体健康中的重要性，在人体正常的生理生化活动起重要调控作用，随着人们对硒认识的逐步加深，硒元素对人体的作用越来越大，在未来的肿瘤治疗中、心血管疾病中以及在瘢痕防治中等多方面，均都会看到硒元素发挥的作用，本课题组会继续探讨硒对人HS的抑制作用机制研究。

[1]杨陆涛，刘美玲，张友来，等.亚硒酸钠对人增生性瘢痕成纤维细胞体外增殖的影响[J].重庆医学杂志，2014，43（35）：4723-4726.

[2]林尊文，徐少宏，游敏，等.人增生性瘢痕成纤维细胞的改良培养和鉴定[J].实用医学杂志，2011，27（24）：4367-4369.

[3] Huelsken J，Behrens J.The Wnt signalling pathway[J].Cell Sci，2002，115（Pt21）：3977-3978.

[4] Sokol S Y.Maintaining embryonic stem cell pluripotency with Wnt signaling[J].Development，2011，138（20）：4341-4350.

[5] Blank U，Karlsson G，Karlsson S.Signaling pathways governing stem-cell fate[J].Blood，2008，111（2）：492-503.

[6] Carre A L，James A W，Macleod L，et al.Interaction of wingless protein（Wnt），transforming growth factor-beta 1，and hyaluronan production in fetal and postnatal fibroblasts[J].Plast Reconstr Surg，2010，125（1）：74-88.

[7] Labus M B，Stirk C M，Thompson W D，et al.Expression of Wnt genes in early wound healing[J].Wound Repair Regen，1998，6（1）：58-64.

[8] Okuse T，Chiba T，Katsuumi L，et al.Differential expression and localization of WNTs in an animal model of skin wound healing[J].Wound Repair Regen，2005，13（5）：491-497.

[9] Sato M. Sato M. Up regulation of the Wnt/β-catenin Pathway Induced by Transforming Growth Factor-β in Hypertrophic Scars and Keloids[J].Acta Derm Venerel，2006，86（4）：300-307.

[10] Cheon S，Poon R，Yu C，et al.Prolonged beta-catenin stabilization and tcf-dependent transcriptional activation in hyperplastic cutaneous wounds[J].Lab Invest，2005，85（3）：416-425.

[11] Ho C，Lee P，Hsu Y C，et al.Sustained Wnt/β-catenin signaling rescues high glucose induction of transforming growth Factor-β1-mediated renal fibrosis[J].Am J Med Sci，2012，344（5）：374-382.

[12] Caraci F，Gili E，Calafiore M，et al.TGF-β1 targets the GSK-3β/β-catenin pathway via ERK activation in the transition of human lung fibroblasts into myofibroblasts[J].Pharmacol Res，2008，57（4）：274-282.