不同白油佐剂制备的H9N2灭活疫苗在SPF鸡上的免疫效果初试验

董伟峰

（山东莱州市文昌路畜牧兽医站，山东 莱州 261400)

禽流感 (Avian influenza，AI)H9N2是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒 (Avian influenza，AIV)所引起的禽类疾病[1]。该病主要通过呼吸道传播，H9亚型禽流感病毒感染鸡群后，会造成商品肉鸡大面积的呼吸系统疾病，同时也会严重影响产蛋鸡的生殖系统，导致产蛋鸡群的产蛋量大幅下降，且病程较长，发生感染时，死亡率增加，药物治疗效果不佳，给养殖业造成严重的经济损失[2]。目前我国用于禽流感H9N2防控的疫苗多为灭活疫苗，所采用的佐剂多数为注射用矿物白油佐剂，但不同厂家生产的注射用白油佐剂粘度和纯度等质量不一，因而其应激、免疫吸收和抗体消长效果差异较大[3,4]。本试验选择3个不同厂家注射用矿物白油佐剂样品，严格按照油乳剂灭活疫苗制造与检验规程标准，进行H9N2灭活疫苗的制备与检验[5]。将检验合格的不同厂家注射用矿物白油佐剂灭活疫苗进行SPF鸡免疫效果试验，对免疫鸡进行采血分离血清检测抗体效价，同时剖检观察注射部位药物吸收、残留情况，通过比较不同厂家注射用矿物白油佐剂的免疫效果差异，为兽医生物制品行业选用合适的矿物白油提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 矿物白油佐剂 不同场家注射用白油型号分别为 WG40、WG50、DDE170，由国内两家不同代理商提供。

1.2 病毒灭活液与标准血清 各项检验合格的鸡H9N2病毒灭活液由山东省农业科学院家禽研究所无特定病原鸡研究室提供。标准H9N2阳性抗原、标准H9N2阳性血清、标准阴性血清由哈尔滨兽医研究所提供。

1.3 培养基和药品 需氧菌培养基、厌氧菌培养基、霉菌培养基等常用培养基由山东省农业科学院家禽研究所制备和保存；吐温-80、司本-80由广州市华南农大生物药品有限公司提供。

1.4 试验材料及设备 28日龄SPF鸡，由山东省农业科学院家禽研究所无特定病原鸡研究室提供；FA25型剪切机，上海弗鲁克公司生产；禽用负压隔离器，苏州安泰公司生产。

1.5 不同厂家注射用矿物白油质量检测 相对密度、运动粘度、稠环芳烃、重金属含量按照《中华人民共和国兽药典》（2010版）的相关规定方法进行检验[6]。

1.6 注射用矿物白油佐剂H9N2灭活疫苗制备与检验 按照油乳剂灭活疫苗的相关规定方法进行制备与检验[6]，每个白油样品制备油乳剂灭活疫苗各250ml。

1.7 注射用矿物白油佐剂H9N2灭活疫苗免疫效果试验 每个白油样品H9N2油乳剂灭活疫苗分别以0.3ml/只剂量，胸部肌肉注射接种28日龄SPF 鸡 30 只， 于接种后 14、21、28、35、42d 分别无菌采血10只鸡进行血清抗体（HI）效价检测。同时每组扑杀5只鸡进行疫苗的药物残留吸收检查。

2 结果与分析

2.1 注射矿物白油质量检测结果 不同厂家注射用矿物白油质量检测项目与数据结果见表1。

表1 不同厂家注射用矿物白油质量检验结果

由表1可知，对照《中华人民共和国兽药典》的质量标准：运动粘度＜7.0的是矿物白油WG40；三种白油稠环芳烃含量吸光度均小于0.10；重金属含量3种白油均ppm＜10。

2.2 注射用矿物白油佐剂H9N2灭活疫苗的检验结果 3种注射用矿物白油佐剂配制的H9N2灭活疫苗检验结果：物理性状检验合格；疫苗粘度分别是 WG40 为 1.7s、WG50 为 2.3s、DDE170 为 2.5s；无菌检验、安全检验均合格。

2.3 注射用矿物白油佐剂H9N2灭活疫苗免疫药物吸收、残留剖检结果 见表2。

表2 注射用矿物白油佐剂H9N2灭活疫苗胸部肌肉注射药物吸收、残留剖检结果

由表2可知，经过5次注射部位剖检检查药物残留情况综合统计，结果显示其白油佐剂吸收较好的顺序是：WG40＞WG50＞DDE170。

2.4 注射用矿物白油佐剂H9N2灭活疫苗免疫HI抗体检测结果 见图1。

图1 不同矿物白油H9N2灭活疫苗免疫抗体消长曲线

将5次血清抗体检测数据绘成由图1可知：不同矿物白油样品H9N2灭活疫苗抗体监测平均值比较发现，WG40 在接种后 14、21、28、35、42d 的抗体均比WG50和DDE170高，且抗体上升快。而WG50和DDE170组在整个免疫期抗体差异不大，从抗体水平看，WG40白油适合用于H9N2油乳剂疫苗的佐剂。

3 讨论

免疫佐剂是指与抗原同时或先于抗原使用，能增强机体针对抗原的免疫应答能力或改变免疫反应类型的物质[7]。选择佐剂时不仅要考虑其免疫促进作用，也要兼顾佐剂的安全性及佐剂与抗原适当比例配制后疫苗的粘度、稳定性等是否符合要求。目前，灭活疫苗尤其是禽用灭活疫苗，通常使用的佐剂是矿物油佐剂，抗体滴度维持时间较长。但是，不同油佐剂对疫苗免疫效果的增强作用可能存在差异[8]。

本试验选择了3种进口油佐剂，与禽流感(H9N2亚型)病毒液配制成灭活疫苗，免疫接种28日龄的SPF鸡均未出现局部肿块及不良反应，说明3种佐剂的生物兼容性较好，易吸收，无毒副作用。经试验，3种进口油佐剂配制的禽流感(H9N2亚型)灭活疫苗免疫28日龄的SPF鸡进行效力检验结果显示，不同佐剂制备的灭活疫苗的抗体效价确实存在明显差异，只有WG40作为佐剂

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电话：（0531）85990243；85975852的疫苗，免疫后2周H9N2流感病毒的抗体达到合格水平，其余佐剂则在免疫3周后才能达到合格水平。实验结果认为WG40白油可以作为30日龄左右育成鸡的禽流感(H9N2亚型)灭活疫苗的理想佐剂，但是以WG40为佐剂的禽流感(H9N2亚型)灭活疫苗在产蛋禽上的实际应用效果还有待进一步试验验证。

参考文献：

[1] 陈伯伦,张泽纪,陈伟斌.禽流感研究 I.鸡 A型禽流感病毒的分离与血清学初步鉴定 [J].中国兽医杂志,1994(10)∶3-5.

[2] 唐秀英,付朝阳.H9亚型禽流感的流行与防制[J].预防兽医学进展,2000(4)∶1-3.

[3] 李明义,范根成,杜元钊,等.禽流感(H5、H9亚型)二价油乳剂灭活疫苗试验研究[J].中国动物检疫,2005,22(4)∶22-24.

[4] 白军,刘淑红.H9亚型禽流感疫苗研究进展[J].畜牧与 饲 料 科 学,2016(11)∶102-103.

[5] 乔荣岑,习向锋,孙进忠,等.鸡新城疫、H9亚型禽流感二联灭活疫苗的制备方法,CN101607084[P].2009.

[6] 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典[M].北京：中国农业出版社,2011.

[7] 沈克飞,曹兰,尹继刚,等.免疫佐剂研究进展[J].动物医 学 进 展,2007,28(s1)∶34-36.

[8] 王振辉,慈洪波,武桂梅,等.不同来源注射用白油佐剂免疫效果分析[J].中国家禽,2013,35(19)∶48-50.