PD-L1对过敏性鼻炎小鼠Treg/Th17细胞免疫失衡调节作用研究*

王 頔，唐桥斐，姜玉秋，张 爽，李赛楠，闫智永

沈阳医学院附属第二医院耳鼻喉科(沈阳110200)

PD-L1对过敏性鼻炎小鼠Treg/Th17细胞免疫失衡调节作用研究*

王 頔，唐桥斐，姜玉秋，张 爽，李赛楠，闫智永△

沈阳医学院附属第二医院耳鼻喉科(沈阳110200)

*沈阳医学院科研基金资助项目(20161006)

△通讯作者

目的：探讨PD-L1对过敏性鼻炎小鼠Treg/Th17细胞免疫失衡的调节作用。方法：将30只BALB/c小鼠随机分三组，模型组和PD-L1重组蛋白干预组给予卵清蛋白(OVA)诱发过敏性鼻炎，PD-L1重组蛋白干预组给予PD-L1重组蛋白进行处理；正常对照组在相同时间点给予生理盐水。采用叠加量化记分法进行搔鼻、喷嚏及鼻溢症状评价；采用HE染色观察鼻黏膜组织的病理变化，采用免疫组化检测鼻黏膜组织PD-1和PD-L1的表达；Western blot检测鼻粘膜组织p-AKT、、AKT、mTOR、p-mTOR的表达；RT-PCR检测鼻黏膜组织调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞17(Th17)重要转录因子Foxp3、RORγt表达；ELISA法检测血清IL-10、IL-17A、IL-6的水平。结果：正常对照组、模型组、PD-L1重组蛋白干预组行为学评分分别为0、(6.33±1.15)、(3.67±0.58)分，组间比较具有统一学意义(P<0.05)。与正常对照组相比较，模型组鼻粘膜组织损伤严重，鼻粘膜组织中PD-1、PD-L1和Foxp3的表达下降，RORγt、p-AKT、p-mTOR的表达增加，血清IL-10水平下降，血清中IL-17A、IL-6的水平升高，AKT、mTOR的表达无明显变化。与模型组相比较，PD-L1重组蛋白干预组鼻粘膜组织损伤减轻，鼻粘膜组织中PD-1和PD-L1和Foxp3的表达上升，RORγt、p-AKT、p-mTOR表达下降，血清IL-10水平升高，血清中IL-17A、IL-6的水平下降；组间比较差异显著(P<0.05)；AKT、mTOR无明显变化。结论：PD-L1通过抑制AKT-mTOR信号进而促进Treg的分化抑制过敏性鼻炎的发生和发展。

过敏性鼻炎是机体接触变应原后主要由IgE介导的鼻黏膜非感染性疾病[1]。过敏性鼻炎是全球范围内发病率较高的过敏性疾病，近20年来我国成人及儿童过敏性鼻炎发病率均呈逐年增加趋势[2]，已经严重影响到人类的生活质量、工作效率、精神状态及睡眠等。既往研究认为过敏性鼻炎的发病由Th1细胞、Th2细胞免疫失衡引起，且主要与Th2细胞应答增强有关[3]。但近年来研究显示，过敏性鼻炎发病过程中出现调节性T细胞(Treg)、辅助性T细胞17(Th17)比例下调[4]。Treg被认为是一群具有免疫抑制作用的细胞，主要分泌TGF-β1和IL-10，叉头状转录因子p3(Forkhead box p3，Foxp3)是其重要调控基因[5]；Th17细胞是另一种新的T细胞亚群[5]，以分泌IL-17A细胞因子为特征，在促进炎症反应和自身免疫性疾病中发挥着重要作用[6]。程序性死亡分子PD-1及其配体PD-L1是CD28/B7超家族的协同刺激分子，介导免疫反应的负性调节信号。PD-1/PD-L1信号途径在Treg细胞增殖、分化以及功能维持中发挥重要作用。同时，有研究证实PD-L1能够通过减弱AKT-mTOR信号诱导初始化T细胞向Treg[7]。

本研究通过建立小鼠过敏性鼻炎的模型，使用PD-L1重组蛋白对其进行干预，检测干预后Treg/Th17平衡的变化，从而揭示PD-L1对过敏性鼻炎小鼠Treg/Th17细胞免疫失衡的调节作用。

材料和方法

1 材料及试剂 6～8周SPF级雄性小鼠BALB/c小鼠30只，购自辽宁长生生物技术有限公司，卵清蛋白(OVA) (美国Sigma公司)、Al(OH)3(天津大茂化学试剂厂)，PD-L1重组蛋白(英国Abcam公司)，PD-1多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，PD-L1多克隆抗体、醇溶的曙红Y(上海生工生物工程有限公司)，p-AKT、AKT、mTOR(沈阳万类生物科技有限公司)，p-mTOR(美国CST公司)，苏木精、DAB显色液(北京索莱宝科技有限公司)，生物素化山羊抗兔IgG(上海碧云天生物技术公司)，小鼠IL-6、IL-10、IL-17A ELISA试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司)，Super M-MLV反转录酶、高纯总RNA快速提取试剂盒、2×Power Taq PCR Master Mix(北京百泰克生物科技有限公司)，其余的试剂均为国产分析纯。

2 动物模型及分组 将BALB/c小鼠随机分为三组，每组10只。模型组(AR)、PD-L1重组蛋白干预组(AR+PD-L1)使用卵清蛋白致敏，100 μg OVA+2 mg氢氧化铝溶于0.1 ml生理盐水中，分别于第0、2、4、6、8、10、12、14 d对小鼠进行腹腔注射，之后分别在第15～25 d，予以100 μg OVA(20 μl)滴鼻激发，1次/d。PD-L1重组蛋白干预组在刺激前鼻内滴注PD-L1重组蛋白(10 μg/20 μl)，对照组及模型组各阶段注射生理盐水作为对照。末次滴鼻局部刺激后2 h处死小鼠，各组小鼠摘除眼球取血后，取各组鼻粘膜组织。

3 行为学评分 最后一次激发完成后，观察小鼠鼻部症状，如搔鼻、喷嚏、鼻溢液等，按照如下标准记录评分：鼻痒：轻度1分，轻搔鼻几次；重度2分，反复搔鼻不止，到处摩擦；喷嚏1～3个为1分，4～10个为2分，11个以上为3分；清水涕：流到前鼻孔1分；超过前鼻孔2分；流涕满面3分，以累计叠加法记录总分，大于5分表示造模成功。

4 HE染色检观察鼻黏膜组织病理变化 取各组小鼠鼻黏膜组织，常规石蜡包埋并切片，60 ℃温箱中2 h，烘干切片；二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，苏木素浸染5 min，伊红浸染3 min；常规脱水，透明，干燥，封片，显微镜下观察组织病理变化。

5 免疫组化检测鼻黏膜组织PD-1、PD-L1表达 取各组小鼠鼻黏膜组织，常规石蜡包埋并切片，60 ℃温箱中2 h，烘干切片；二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，微波加热修复抗原；3% H2O2室温孵育15 min灭活内源性过氧化物酶，山羊血清封闭；加入PD-1和PD-L1一抗，湿盒内4 ℃过夜孵育；山羊二抗孵育30 min，滴加辣根过氧化物酶(HRP)进行标记，DAB显色；苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片，显微镜下观察染色情况。PD-1、PD-L1均以细胞质呈棕黄色至棕褐色为阳性。

6 Western blot检测鼻粘膜组织p-AKT、p-mTOR、AKT、mTOR的表达 取各组小鼠鼻黏膜组织，提取组织总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；取40 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，转移到PVDF膜上，5%脱脂乳封闭；加入p-AKT、p-mTOR、AKT、mTOR一抗，4 ℃过夜孵育；加入二抗，37 ℃孵育45 min，ECL显影，β-actin作为内参进行标准化处理。

7 RT-PCR检测鼻粘膜组织Foxp3和RORγt的表达 收集小鼠鼻粘膜组织，总RNA提取试剂盒提取样本总RNA，紫外分光光度测定RNA质量浓度及鉴定纯度。在Super M-MLV反转录酶作用下，将RNA反转录成cDNA。利用Primer 5.0设计上下游引物，引物信息见表1。利用PCR对β-actin、Foxp3和RORγt进行扩增，PCR反应程序为：95 ℃保持5 min使模板DNA充分变性；然后进入扩增循环，在每一个循环中，95 ℃保持20 s使模板变性，52 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，重复循环36次；25 ℃保持5 min，使产物延伸完整。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统对得到的凝胶进行拍照。利用Image J软件对核酸电泳照片进行灰度分析，得到各样本中基因的相对表达量。

表1 RT-PCR引物信息

8 ELISA检测血清IL-10、IL-17A、IL-6水平 取各组血清样本，按照ELISA试剂盒说明书检测血清中IL-10、IL-17A、IL-6的水平。

9 统计学方法 所有数据以均数±标准差表示，使用SPSS19.0进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 行为学评分比较 正常对照组无喷嚏、搔鼻及清水涕症状；模型组频繁搔鼻，喷嚏及清水涕较多；PD-L1重组蛋白组较模型组症状减轻。对照组、模型组、PD-L1重组蛋白干预组行为学评分分别为0、(6.33±1.15)、(3.67±0.58)分，三组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2 各组鼻粘膜病理组织变化 HE染色结果可见，与正常对照组相比较，模型组和PD-L1重组蛋白干预组的鼻粘膜上皮细胞排列紊乱，上皮层变薄，上皮细胞间连接疏松，上皮层下间质水肿，可见散在大量嗜酸细胞为主的炎症细胞浸润；与模型组相比较，PD-L1重组蛋白干预组鼻粘膜上皮细胞排列较整齐，上皮层变厚，上皮细胞间连接较紧密，嗜酸细胞浸润明显减少(图1)。

3 各组鼻粘膜组织PD-1、PD-L1表达变化 PD-L1通过与其受体PD-1的相互作用，介导免疫反应的负性调节信号，从而诱导免疫抑制。在正常对照组，PD-1和PD-L1在鼻粘膜组织中高表达，并且表达在胞质和胞浆中；在模型组中PD-1和PD-L1的的阳性细胞数明显减少；与模型组相比较，PD-L1重组蛋白干预组中PD-1和PD-L1的阳性细胞数明显增加(图2)。

4 各组鼻粘膜组织p-AKT、p-mTOR、AKT、mTOR的表达 与正常对照组相比，p-AKT、p-mTOR的表达水平升高，AKT、mTOR的表达水平没有明显变化；与模型组相比较，p-AKT、p-mTOR的表达水平下降，AKT、mTOR的表达水平没有明显变化(图3)。

5 各组鼻粘膜组织Foxp3和RORγt表达变化 Foxp3为Treg细胞的重要转录因子，RORγt为Th17细胞特异性转录因子，二者的表达水平能够间接反映Treg/Th17的平衡变化。与正常对照组相比较，模型组和PD-L1重组蛋白干预组Foxp3表达水平显著下降，RORγt表达水平上升；与模型组相比较，PD-L1重组蛋白干预组Foxp3表达水平上升，RORγt表达水平下降(图4)。

图4 RT-PCR检测鼻粘膜组织中Foxp3和RORγt的表达

6 各组血清中IL-10、IL-17A、IL-6水平变化 与正常对照组相比较，模型组和PD-L1重组蛋白干预组血清IL-10水平下降、IL-17A、IL-6水平上升(P<0.05)；与模型组相比较，PD-L1重组蛋白干预组IL-10水平上升，IL-17A、IL-6水平下降(P<0.05)(图5)。

图5 ELISA检测血清中IL-10、IL-17A、IL-6的水平(*P<0.05；与AR组比较，#P<0.05)

讨 论

过敏性鼻炎是由IgE介导的鼻黏膜I型超敏反应。Treg和Thl7是近年来发现的CD4+T细胞亚群。研究表明，Treg/Thl7失衡参与过敏性鼻炎的发病过程[8]。Foxp3是诱导CD4+T向Treg分化的重要转录因子，分化的Treg细胞分泌IL-10和TGF-β，抑制效应性T细胞、树突状细胞和单核巨嗜细胞活化，发挥免疫抑制作用[9]。Th17细胞分泌其中IL-17A与体内广泛表达的受体表达的IL-17受体结合，诱导上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等靶细胞释放IL-8，IL-6，GM-CSF、TNF-a、CXCL1、CXCL5等前炎症细胞因子、趋化因子，发挥促炎作用[10]。Th17细胞的分化受转录因子RORγt的特异性调控。

PD-1/PD-L1结合负性调控免疫反应，在自身免疫性疾病中发挥重要的作用[11]。PD-L1可通过增强诱导性调节性T细胞(Treg)上Foxp3表达诱导Treg细胞分化，并维持其功能，PD-L1缺失导致体内Treg细胞受损[12]。Sheetal等证实在雌二醇介导的EAE小鼠模型中，敲除PD-L1伴有Th17水平的显著增加[13]。AKT-mTOR在调节CD4+T细胞分化过程中也发挥重要作用，激活AKT-mTOR会维持Th17细胞的稳定和增殖，抑制Treg细胞的产生[14]。有研究表明[15]，抗原提呈细胞表面的PD-L1可以通过抑制T细胞中的AKT-mTOR的激活从而促进Treg细胞的分化、维持其功能。田玫[16]等亦证实，PD-L1促进子痫前期CD4+T向Treg分化，并证明通过下调p-AKT、p-mTOR来实现的。说明PD-L1可以通过抑制AKT-mTOR的激活促进Treg细胞的分化。基于PD-1/PD-L1在机体免疫调节中的作用，PD-1与其配体PD-L1介导的信号途径正成为通过免疫干预进行临床疾病治疗的手段之一。

本研究结果显示，PD-L1重组蛋白干预后，能有效缓解小鼠过敏性鼻炎症状，减轻过敏小鼠的鼻粘膜组织损伤，增加程序性死亡分子PD-1及其配体PD-L1的表达，进而增加Treg特异性转录因子Foxp3表达及上调Treg细胞因子IL-10水平，降低Th17转录因子p-AKT、p-mTOR、RORγt表达和下调细胞因子IL-17A和IL-6的水平，表明PD-L1可能通过调节Treg/Th17的比例，抑制过敏性鼻炎的发生。PD-1/PD-L1信号途径有望成为过敏性鼻炎的治疗靶点。

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(收稿：2017-11-06)

TheeffectsofPD-L1onimbalanceofTreg/Th17cellinallergicrhinitisofamurinemodel.

Wang Di,Tang Qiaofei,Jiang Yuqiu,et al.

Otolaryngology Department, Second Affiliated Hospital, Shenyang Medical College (Shenyang 110200)

Objective: To investigate the effects of PD-L1 on imbalance of Treg/Th17 cell in allergic rhinitis (AR) of a murine model. Methods: Thirty BALB/c mice were randomly divided into three groups, ten animals in each．The mice in the model group and PD-L1 recombinant protein group (PD-L1 group) received ovalbumin (OVA) to reduce allergic rhinitis．Then, The mice were intervented with recombinant PD-L1 protein. Mice in the control group were administrated normal saline. Pathological findings of nasal mucosa was analyzed by hematoxylin and eosin stain, The positive cells of PD-1 and PD-L1 in nasal mucosa was analyzed by immunohistochemistry. The expression of Foxp3 and RORγt in nasal mucosa was measured by RT-PCR. The concentration of IL-10, IL-6 and IL-17A in serum was detected by ELISA．Results:The behavioral scores for the control，model and PD-L1 groups were 0,(6.33±1.15),(3.67±0.58)respectively (allP<0.05).serious pathological damage occured in nasal mucosa in model group, whereas damage eased in PD-L1 group. Significantly decreased concentration of PD-1, PD-L1, Foxp3 in nasal mucosa and IL-10 in serum was observed in model group compared with that of the control group (P<0.05), while significantly increased expression of IL-17A, IL-6 in serum and p-AKT、p-mTOR RORγt in nasal mucosa was found (P<0.05). AKT and mTOR change non-significantly and the opposite trends for PD-L1 group compared with the model group(P<0.05). Conclusion: PD-L1 may inhibited AR by inhibiting AKT-mTOR signal pathway and then promoting the differentiation of Treg cells．

Rhinitis,allergic，seasonal/immunology @Recombinant proteins @Regulatory T cells Th17 cells Mice

鼻炎,过敏性，季节性/免疫学 重组蛋白质类 @调节性T细胞 Th17细胞 小鼠

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2018.03.004