miR-142-3p在结直肠癌组织与细胞中的表达及对细胞增殖影响研究*

朱文侠，杨 玲，成 钧，杨彦玲，韩振奎，韩继明，黄广智，王航辉

1.延安大学医学院 (延安716000)， 2.西安交通大学附属红会医院 (西安 710054)

miR-142-3p在结直肠癌组织与细胞中的表达及对细胞增殖影响研究*

朱文侠1，杨 玲1，成 钧1，杨彦玲1，韩振奎1，韩继明1，黄广智1，王航辉2△

1.延安大学医学院 (延安716000)， 2.西安交通大学附属红会医院 (西安 710054)

*陕西省教育厅科学研究计划项目(2013JK0754)

中国博士后科研项目(2016M600804)

陕西省博士后科研项目(2016BSHEDZZ92)

西安市卫生和计划生育委员会科研项目(J201602023)

西安市红会医院科研项目(YJ2014008)

西安市科技局科研项目[2017115FS/YX009(16)]

△通讯作者

目的：观察微小RNA-142-3p在结直肠癌组织与细胞中的表达，及其对人结直肠癌细胞增殖的影响。方法：通过组织原位杂交的方法，检测miR142-3p在结直肠癌患者组织中的表达。通过Realtime-PCR检测结直肠癌细胞系中的miR142-3p表达。构建pSliencer 4.1-CMV-miR142-3p过表达载体，并转染结直肠癌细胞Caco2，通过Realtime PCR检测重组质粒pSilencer4.1-CMV-miR142-3p载体在结直肠癌细胞系的表达情况。通过Western Blot检测细胞周期相关蛋白CyclinD1的表达变化。结果：miR142-3p主要定位于细胞的胞浆，在癌组织和癌旁组织中miR142-3p的表达存在差异。miR142-3p结直肠癌细胞系中呈低表达。在结直肠癌细胞系中过表达miR142-3p可下调细胞周期相关蛋白CyclinD1，抑制细胞增殖。结论：miR142-3p抑制结直肠癌Caco2细胞的增殖，下调细胞周期相关蛋白CyclinD1，有望成为结直肠癌诊断和治疗的潜在靶点。

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC )是最常见的恶性肿瘤之一。其发病率在恶性肿瘤中居第3位，病死率居第4位，成为危害人类生命健康的重要疾病[1-6]。微小RNA (microRNAs，miRNAs)是一类长18～25个核苷酸的小分子非编码RNA，直接与靶基因mRNA 3'UTR结合，这可能进一步导致靶mRNA的降解或抑制蛋白质翻译，诱导mRNA降解或抑制其翻译，从而在转录后水平对靶基因进行调控，一个microRNA可以调节许多靶基因，同时被许多基因调控。通过抑制其转录后水平靶基因的表达，已经证明了miRNAs在调节各种细胞过程(如细胞代谢、增殖、分化和细胞凋亡等生物学过程)以及纤维化中起重要作用[7-10]。研究表明miR-142-3p与肿瘤的发生、发展有关。例如，微小RNA-142-3p在肾细胞癌中表达上调，与肾细胞癌细胞迁移，增殖和凋亡有关[11]。MicroRNA-142-3p调控Wnt信号通路并在乳腺癌的发病中扮有重要作用[12-13]。然而，miR-142-3p是否在结直肠癌的发病机制中起重要作用方面的研究较少，本文拟就该就此发病机制进行如下研究。

材料与方法

1 材料与仪器 细胞株购自中国科学院上海细胞生物学研究所，胎牛血清(Gibco BRL)，DMEM培养基、RPMI-1640培养基(Hyclone)，转染试剂lipo-2000(Invitrogen公司)，SYBR Green试剂盒(大连Takara公司)，原位杂交检测试剂盒(博士德公司)，hsa-miR-142-3p地高辛探针(Exiqon，18043-15)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，定量PCR仪(ABI公司7500)，紫外光密度分析仪(上海复日公司)，分光光度计(Eppendof, Hamburg, Germany)，电泳仪(Bio-Rad公司)。

2 细胞与细胞培养 细胞常规培养在DMEM、RPMI-1640培养基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)或K-SFM培养基(含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素)中，于含5% CO2和95% O2混合气体的37 ℃培养箱里培养；根据细胞生长状况，每2～3天传代1次，以保持细胞处于对数生长期； 所有细胞在实验期间全部进行支原体检测，结果均为阴性；经台盼蓝染色分析细胞活力，活力均保持在90%以上。

3 组织原位杂交 组织原位杂交操作过程如下：石蜡切片60℃烤片过夜；二甲苯脱蜡至水；去离子水洗3遍；抗原修复。将片子于1%柠檬酸钠液(pH6.0)中微波热修复，取出后放置于100℃烤箱15min；去离子水洗3遍；3%过氧化氢室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性；去离子水洗3遍；胃蛋白酶消化8 min；去离子水洗3遍；梯度酒精脱水，室温晾干>20 min；加miR142-3p探针12.5nM/张，封口膜封片，42℃水浴过夜>10h；洗膜液(2XSSC+0.1%SDS，pH7.0)42℃洗3次，30 min /次；洗膜液(2XSSC+0.1%SDS，pH7.0)室温摇床洗3次，15 min /次；PBST(0.01%TWEEN20，pH7.4)室温摇床洗3次，5 min /次；封闭液室温封闭20 min；生物素化鼠抗地高辛37℃孵育1h；PBST(0.01%TWEEN20，pH7.4)室温摇床洗3次，5 min /次；SABC-POD室温孵育30 min；PBST(0.01%TWEEN20，pH7.4)室温摇床洗3次，5 min /次；DAB显色，显微镜下观察15～30s(DAB)，充分水洗，终止反应；自来水冲洗，苏木素复染。经梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

4 实时逆转录PCR 按照SYBR Green试剂盒说明书 (大连Takara公司) 操作。反应体系见表1～2。每组设三个复孔，通过计算标准差来衡量实验误差。反应在专用的96孔板(MicroAmp optical 96-well)中进行，以Optical adhesive covers (Applied Biosystems)封口，在 ABI7500 FAST 仪器上设定两步法 PCR扩增程序，详细过程如下：Stage I：95 ℃ 30 sec，循环一次；Stage II： 95 ℃ 5 sec，60 ℃ 30 sec，循环 40 次；Stage III：95 ℃ 15 sec，60 ℃ 30 sec，95 ℃ 15 sec，循环 40 次。采用ABI 7500 fast仪器附带的软件分析数据，计算出荧光信号超过背景荧光强度所对应的阈值，即循环数Ct 值。计算目的基因与内参β-actin的CT值之差(ΔCt)，以此来反映在等量cDNA起始反应的情况下目的基因表达的差异。Real-Time PCR最终的结果以2-ΔΔCt表示，体现出实验组目的基因的表达相对于内参表达量的变化倍数，使用这一方法可以直接得到目的基因相对于管家基因的定量。

表1 142-3p引物序列表

表2 miR142-3p表达载体引物序列表

5 载体构建 以pSliencer 4.1-CMV-puro为载体，选取BamHⅠ和HindⅢ两个酶切位点，插入miR142-3p片段。总共选取两段，一段为174bp(87bp miR142-3p前体序列+上游35碱基+下游52碱基),一段为417bp(87bp miR142-3p前体序列+上游181碱基+下游150碱基)。30l PCR反应体系包括：3l 10×KOD buffer， 1.2l MgSO4，3l dNTP，0.5l 正向引物(10M)，0.5l反向引物(10M)，2l K562DNA 模板，1l KODase，18.8l双蒸水补足30l。反应程序按照：95 ℃5 min，重复如下循环35次：94 ℃ 30 s，65 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min。最后72 ℃ 10 min(图1)。

图1 pSliencer4.1-CMV-puro载体图谱

6 蛋白印迹 本研究中蛋白印迹实验(Western blot)的详细操作步骤如下：用预冷的0.01 M 的PBS缓冲液(pH 7.4)润洗细胞2次，按照细胞密度加入适量的含DTT 的2×SDS裂解液，彻底裂解细胞，并收集至EP管中，Type17600 Dri-Bath 调节温度至95℃，95 ℃煮10 min，冰上放置10 min，重复2次，使蛋白彻底变性，再用95 ℃ 煮 10 min后，12 000 rpm，室温离心 5min，将上清(即总蛋白)移至另一干净的EP管中。 利用BCA蛋白质定量试剂盒测定蛋白浓度，蛋白保存在-80℃冰箱备用，以防降解。根据蛋白定量结果，以10孔板，每孔上样10 μl蛋白样品为例，配制蛋白上样体系，不足的体积用2×SDS裂解液补足，同时加入溴酚蓝示踪。根据目的蛋白分子量大小配制8%～12%的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行电泳分离目的蛋白。

上样完成后，首先用电压80 V电泳至分离胶时换电压为120 V，直至溴酚蓝示踪条带电泳至电泳槽底部，终止电泳。电泳结束后，取出电泳胶，在预冷的转膜液中进行转膜，去除积层胶，将含有蛋白质的分离胶安放在Western blot专用三明治式转膜夹中，安放顺序由负极至正极依次为黑板、海绵、滤纸、分离胶、PVDF膜、滤纸、海绵和白板。转膜采用湿转法，恒流 300 mA或恒压100 V，转膜时间根据蛋白质分子量设定为 1 h 40 min，将蛋白转移至NC膜上。转膜结束后，注意与分离胶接触的一面朝上，用TBST将PVDF膜漂洗1次，经丽春红染色评估蛋白电泳、转膜以及蛋白定量的情况，然后用TBST漂洗PVDF膜3次，每次5 min，充分洗涤直至将丽春红染色洗净。将PVDF膜孵育在TBST配制的5%的脱脂奶粉中，室温 1 h，以封闭PVDF膜上的非特异性结合位点。封闭结束后，将PVDF膜孵育在TBST配制的目的蛋白的相应一抗中，室温 1 至 2 h 或4 ℃ 孵育过夜。TBST漂洗PVDF膜3 次，室温，每次10 min，再将PVDF膜孵育在相应的辣根过氧化物酶标记的二抗中，室温 1 h。TBST漂洗PVDF膜3次，室温，每次10 min。抗原抗体复合物用Immobilon Western Chemilminescent HRP Substrate试剂进行显影，在Fluor Chem E扫膜仪器上检测蛋白表达情况并曝光存图。

7 统计学方法 采用SPSS 18.0统计学软件进行统计分析。计量资料用均数±标准差表示。正态分布的两组组间比较采用t检验；非正态分布的两组组间比较采用非参数检验；率的比较采用卡方检验和确切概率法，P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 miR142-3p在结直肠癌组织中表达下调 对20例结直肠癌病人的肿瘤组织样本和20例癌旁组织通过组织原位杂交的方法，检测miR142-3p的表达及定位。实验结果显示，miR142-3p成熟体主要定位于细胞的胞浆，根据miR142-3p表达的强弱，主要判断标准是按照原位杂交染色的强度分为三个等级，阴性(-)、弱阳性(+)和强阳性()，在20例癌组织中miR142-3p阳性表达9例(45%)，其中弱阳性表达7例(35%)，强阳性表达2例(10%)；在20例癌旁组织中miR142-3p阳性表达18例(90%)，其中弱阳性表达2例(10%)，强阳性表达16例(80%)，说明在癌组织和癌旁组织中miR142-3p的表达差异具有统计学意义(P值<0.01,图2)。

A:组织原位杂交检测hsa-miR142-3p成熟体在各种类型结肠病变的表达情况(正常粘膜上皮、高分化腺癌、低分化腺癌和粘液癌)；B:比较hsa-miR142-3p成熟体在结直肠癌患者癌旁组织和癌组织表达的差异(癌旁组织n=20例，癌组织n=20例);表达强度分别记为阴性(-)、弱阳性(+)和强阳性()，*P<0.01

图2 结直肠癌组织hsa-miR142-3p的表达

2 miR142-3p结直肠癌细胞系中呈低表达 通过Realtime-PCR检测结直肠癌细胞系SW1116、Caco2、HCT-116、Lv-174T中的miR142-3p表达含量(K562细胞作为阳性对照)，发现结直肠癌细胞系中miR142-3p的表达量很低(图3)。

3 结直肠癌细胞系中过表达miR142-3p下调细胞周期相关蛋白，抑制细胞增殖 将miR142-3p的表达载体(417bp)在结直肠癌细胞系Caco2中瞬时过表达，48 h后细胞计数发现过表达外源性miR142-3p的这组细胞与对照组相比增殖速度明显减慢，说明外源性的miR142-3p能够明显抑制结直肠癌细胞Caco2的增殖。同时Western Blot检测蛋白发现，过表达外源性miR142-3p 48 h后能够使细胞周期相关蛋白CyclinD1在蛋白水平表达下降(图4)。

图3 结直肠癌细胞系中miR142-3p的表达

A:从K562基因组DNA中分别克隆长174bp和417bp的miR142-3p片段，构建到miRNA的表达载体pSilencer4.1-CMV，通过Realtime PCR检测重组质粒pSilencer4.1-CMV-miR142-3p载体在结直肠癌细胞系SW1116的表达情况；B:在结直肠癌细胞系Caco2中瞬时转染重组质粒miR142-3p 417，pSilencer4.1-CMV作为阴性对照，48 h后细胞计数评价细胞增殖情况；C:在结直肠癌细胞系Caco2中瞬时转染miR142-3p表达载体miR142-3p 417片段，pSilencer4.1-CMV作为阴性对照，48 h后通过Western Blot检测细胞周期相关蛋白CyclinD1的表达变化

图4 过表达miR142-3p能够抑制细胞增殖

讨 论

miRNAs在细胞的生长 、分化 、增殖 、发育 、凋亡和代谢等多种过程中发挥着重要作用 ，miRNAs表达的失衡会导致肿瘤的发生，miRNAs 与结直肠癌的发生、发展密切相关[14-21]。

本研究发现在正常结直肠癌旁组织的粘膜中miR142-3p高表达，癌组织中表达减少，并且随着肿瘤分化程度的降低，miR142-3p的表达也随之减少。在结直肠癌细胞系中miR142-3p的表达下调。过表达miR142-3p能抑制结直肠癌Caco2细胞的增值。Zhang等[22]将miRNA-143靶向作用于MACC1的3UTR，下调 MACC1表达； 提示 miRNA-143可能直接作用于其靶分子MACC1，抑制癌细胞侵袭。BOL等[23]发现在CRC细胞系和组织样本中miRNA-152表达下调；恢复CRC细胞中miRNA-152表达后，CRC细胞增殖、迁移和入侵显著减少； PIK3R3是miRNA-152直接和功能性下游靶目标，PIK3R3表达和miRNA-152表 达呈负相关；下调PIK3R3表达使miRNA-152超表达，抑制肿瘤细胞生长。另有研究表明[24-28]，一部分miRNAs在肿瘤中呈高表达。我们的研究与BOL等的研究获得了相似的结果，我们推测miR142-3p与miRNA-152等一部分miRNAs在结直肠癌的发生、发展中起负性调控，另外一部分miRNAs起正性调控作用，如何精准调控？有待于进一步研究。

如何特异性地将 miRNA的激活剂及抑制剂引入肿瘤细胞，以及如何利用 miRNA的表达谱为早期结直肠癌提供诊断和治疗依据[29-33]，将是我们面临的挑战与机遇。

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(收稿：2017-09-18)

TheexpressionofmiR-142-3pincolorectalcanceranditseffectonproliferation

Zhu Wenxia，Yang Ling，Cheng Jun,et al.

Medical College of Yan’an University(Yan’an 716000)

Objective: To observe the expression of microRNA-142-3p in colorectal cancer and its effect on the proliferation of human colorectal cancer cells. Methods: The expression of miR142-3p in the tissues of colorectal cancer was detected by in situ hybridization. The expression of miR142-3p in colorectal cancer cell lines was detected by Realtime-PCR. Construction of pSliencer 4.1-CMV-miR142-3p overexpressing vector, the colorectal cancer cells Caco2 was transfected. The expression of recombinant plasmid pSilencer4.1-CMV-miR142-3p vector in colorectal cancer cell lines was detected by Realtime PCR. The expression of CyclinD1 was detected by Western Blot. Results: miR142-3p was mainly located in the cytoplasm of cells, The expression of miR142-3p was different in cancer tissues and adjacent tissues. The expression of miR142-3p in colorectal cancer cell lines was low. Overexpression of miR142-3p in colorectal cancer cell lines may down-regulate the expression of cell cycle-associated protein CyclinD1, which inhibit cell proliferation. Conclusion: miR142-3p can inhibits the proliferation of colorectal cancer CAGE2 cells and down-regulation the expression of CyclinD1 and is expected to be a potential target for the diagnosis and treatment of colorectal cancer.

Colorectal neoplasms/physipathology @MicroRNA 142-3p Proliferation

结直肠肿瘤/病理生理学 @微小分子142-3p 增殖

R392.3

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2018.03.003