响应面法优化茶叶嫩化牦牛肉工艺

高麦瑞，陈 琳，李思宁，何 强，曾维才，唐善虎

(1.四川大学轻纺与食品学院，四川 成都 610065；2.西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041)

牦牛生长于我国青藏高原，牦牛肉具有高蛋白、低脂肪的特点，具有很好的营养价值，是一种天然绿色食品[1].然而，牦牛生长在高寒高海拔地区，活动量较大，肌纤维直径较粗，且生长周期长，使得牦牛肉的嫩度较差，其炖制通常需要较长时间才能达到适口的嫩度[2].嫩度是评价肉品食用品质最重要的指标[3-5]，所以牦牛肉的嫩化引起了许多学者的兴趣.张丽等[6]采用宰后成熟的方式对牦牛肉进行嫩化；韩玲[7]使用木瓜蛋白酶嫩化牦牛肉；田园[2]通过宰后电刺激的方法嫩化牦牛肉.

茶叶富含茶多酚，茶多酚可通过氢键、疏水作用等与蛋白质产生结合[8].多酚化合物和蛋白质的相互作用是目前的研究热点.据报道[9]，肉品在炖制过程中，剪切力值下降的原因可能是因为凝胶的形成.张慧芸等[10]发现酚类化合物可提高猪肉肌原纤维蛋白凝胶的保水性，改善凝胶微观结构；吕宏宇等[11]发现氧化酚类化合物的添加可以提高鲫鱼鱼糜的凝胶强度.上述研究为利用酚类化合物嫩化肉品提供了可能性.

为提高牦牛肉产品品质，本文采用响应面回归设计，以茶叶作为嫩化因子，对牦牛肉炖制工艺进行优化，以硬度值、剪切力值和感官评分作为响应值，研究茶叶对牦牛肉品质的影响，并探究茶叶嫩化牦牛肉的最佳条件.

1 材料与方法

1.1 原辅料

牦牛(Bos grunniens)肉采集于四川省红原县，茶叶购于四川省叙永县.

1.2 试验器材

HWS-26电热恒温水浴锅，上海齐欣科学仪器有限公司；CW-5分光测色仪，柯尼卡美能达控股公司；TA.XT plus物性测试仪，英国Stable Micro System公司；气相色谱质谱联用仪GCMS-QP2010SE，日本岛津公司；DB-5MS(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)色谱柱，美国安捷伦公司；顶空固相微萃取器SPME手动进样装置(包括 SPME手动进样手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头)，美国Supelco公司；20 mL顶空进样瓶及 PTFE/S瓶盖，美国Agilent公司；DF-101S磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限公司.

1.3 试验设计

以温度、时间和茶叶用量为考察因素，以硬度值、剪切力值和感官评分为响应值，在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken(BBD)试验设计进行三因素三水平的响应面分析优化茶叶嫩化牦牛肉的最佳工艺.

1.4 样品处理

选择牦牛背最长肌为原料，剔除筋膜、肌腱、淋巴、碎骨、油等部分，清洗干净，然后切成厚度为1 cm的小块备用.

1.5 单因素试验

先固定条件(时间60 min，茶叶用量1%)，考察温度(50、60、70、80、90、100 ℃)对牦牛肉嫩度的影响.再固定条件(温度50℃，茶叶用量1%)，考察时间(15、30、60、90、120、150 min)对牦牛肉嫩度的影响.最后固定条件(温度50℃，时间60 min)，考察茶叶用量(0%、0.5%、1%、2%、3%、4%)对牦牛肉嫩度的影响.

1.6 响应面工艺优化试验

在单因素试验的基础上，采用BBD试验设计原理，对影响牦牛肉嫩度的温度(A)、时间(B)和茶叶用量(C)三个因素，使用Design Expert 8软件设计了三因素三水平的试验方案，且对拟合方程做方差分析和显著性检验，响应面因素设计如表1所示.

表1 响应面法试验因素及水平编码表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.7 指标测定

1.7.1硬度测定

取出炖制好的牦牛肉样品，用冷水冷却后，修整为长约2 cm、宽约2 cm、厚1 cm的肉块，至少使用5块不同的肉块在质构仪上用TPA模式测定硬度值，取平均值.试验采用P10探头，测试前速率为3 mm/s，测试速率为1 mm/s，测试后速率为1 mm/s，初始触发力为10 g，压缩比为75%，测定时间间隔为5 s[12].

1.7.2 剪切力测定

取出炖制好的牦牛肉样品，用冷水冷却后，沿着肌纤维方向切取长约2 cm、宽1 cm、厚1 cm的肉条，至少使用5根不同的肉条在质构仪上测定剪切力值，取平均值.试验采用HDP/BSW探头，测试前速度为2 mm/s，测试速度为2 mm/s，测试后速度为10 mm/s，压缩距离为30 mm，初始触发力为10 g[13].

1.7.3 感官评定

感官评价参考周珠法[14]的评价方法.选择接受过专业训练的10名食品领域专业人士组成感官评定小组，根据牛肉感官质量评分标准(表2)给予评分， 计算平均值.

表2 牛肉的感官评定标准Table 2 Standards of sensory evaluation of yak meat

1.7.4 色差测定

采用CW-5分光测色仪在室温条件下进行色差测定.测量类型为反射率，镜面光为SCI，测量区域为3 mm.测试时将肉样垂直紧扣在镜口，每个样品平行测定3次[15].

1.7.5 风味成分鉴定

将熟牛肉样品斩拌成肉糜后，准确称取肉糜8 g，装入20 mL顶空萃取瓶中，用PTFE/S瓶盖密封后，采用静态顶空固相微萃取方法进行风味成分的提取.将复合式DVB/CAR/PDMS萃取头插入密封的萃取瓶内，萃取头暴露在瓶内样品上部的顶空中，于50℃萃取40 min.气谱条件:采用Agilent DB-5MS气相色谱柱(30 m ×0.25 mm ×0.25 μm)；载气为高纯氦气(1.0 mL/min)；采用电子轰击电离(EI)离子源，电子能量70 eV；离子扫描范围33-400 m/z；离子源温度200℃，接口温度250℃，进样口温度250℃；采用不分流进样.程序升温条件:初始温度40℃，保持1 min；然后以5℃/min升到130℃，再以8℃/min升到200℃，最后以10℃/min升到260℃并保持7 min.化合物的鉴定根据Wiley和NIST 14数据库检索，并参考相关文献；采用峰面积归一法计算相对含量.

1.8 数据处理

采用SPSS 23软件中的one-way ANOVA进行方差分析和显著性检验，采用Design Expert 8分析试验结果，建立以硬度值(Y1)、剪切力值(Y2)和感官评分(Y3)为响应值的评价体系，建立三因素三水平的回归方程.然后将得到的三个方程联立求解，以期得到同时满足嫩度和感官要求的最优嫩化工艺.

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 温度对牦牛肉剪切力值的影响

茶叶用量和时间分别为1%和60 min时，温度在50～100°C范围内的剪切力值变化见图1.温度被认为是加热过程中影响肉嫩度的最主要因素[16].由图可知，随着加热温度的升高，牦牛肉的剪切力值总体呈先增大后减小的趋势，温度对剪切力值有着显著影响(P＜0.05)，与孙红霞等[13]的研究一致.剪切力的上升主要由肌原纤维蛋白的变性引起[17].80～100°C左右剪切力值的下降的原因可能是因为胶原蛋白形成了凝胶[9].考虑到低温炖制牛肉可能存在的食品安全隐患和实际情况，本实验选择90°C作为响应面的中心点.

图1 温度对牦牛肉剪切力的影响Fig.1 The influence of temperature on shear force of yak meat

2.1.2 时间对牦牛肉剪切力值的影响

当温度和茶叶用量分别为50°C和1%时，作用时间在10～120 min范围内的剪切力值变化见图2，时间对剪切力值的影响不显著(P＞0.05).在10 min到60 min范围内，剪切力值变化较小；当加热到60 min以后，剪切力值略有下降，90 min的时候有最小值，随着时间延长，剪切力值略有回升.最终选择作用时间90 min为响应面的中心点.

图2 时间对牦牛肉剪切力的影响Fig.2 The influence of time on shear force of yak meat

2.1.3 茶叶用量对牦牛肉剪切力值的影响

当温度和时间分别为50°C和60 min时，茶叶用量在0～4%范围内的剪切力值变化见图3.当茶叶用量在0～1%的范围内，剪切力值随着茶叶用量的增加而显著降低(P＜0.01).茶叶富含茶多酚，据Rawel等人[19]的研究，酚类化合物可与赖氨酸、色氨酸和半胱氨酸残基反应，促进蛋白质聚合形成凝胶；而牦牛肉含有丰富的赖氨酸[20]，为茶叶促进牦牛肉嫩化提供了理论依据.而当茶叶用量从1%增加至4%时，剪切力值变化较为平缓，在1% ～3%的范围内降低不显著(P＞0.05)，并且当茶叶用量大于3%时，剪切力值略有回升.最终选择茶叶用量为2%作为响应面的中心点.

图3 茶叶用量对牦牛肉剪切力的影响Fig.3 The influence of tea dosage on shear force of yak meat

2.2 响应面法优化茶叶嫩化牦牛肉结果

2.2.1 响应面回归模型的建立及交互作用分析

根据单因素试验结果，筛选温度(A)、时间(B)和茶叶用量(C)中的合适条件进行三因素三水平的BBD试验，试验设计和结果见表3.

表3 Box-Behnken试验设计及结果Table 3 Results of Box-Behnken experiment

使用Design Expert 8分别得到硬度值(Y1)、剪切力值(Y2)和感官评价得分(Y3)与因素A、B、C的三元二次多项式回归方程:

方程1:Y1＝5.97-1.24A-0.11B-0.83C+0.17AB+0.33AC+0.20BC-0.27A2+0.077B2+0.37C2

方程2:Y2＝11.93-1.14A+0.28B-0.74C+0.21AB-0.49AC+0.19BC+0.69A2+1.01B2+0.57C2

方程3:Y3＝84.80+4.50A+0.75B+3.25C-0.25AB-1.75AC-0.25BC+1.98A2-0.52B2-1.03C2

对上述进行方差分析和显著性检验(结果见表4)并对试验中各因素的交互作用(结果如图4所示)进行分析可知，三个回归模型均达到极显著水平(P＜0.01)， R2分别为 0.9830、0.9267 和 0.9885，失拟检验不显著(P＞0.05)，说明模型和实际结果能良好地拟合；试验各因素间交互作用明显.三个方程可以正确地反映硬度值(Y1)、剪切力值(Y2)和感官评分(Y3)与温度(A)、时间(B)和茶叶用量(C)三因素之间的关系.

表4 响应值的方差分析结果Table 4 Analysis of variance for the regression equation

图4 各因素对硬度值、剪切力值和感官评分影响的响应面图.Fig.4 Response surface graphs showing the effect of various factors on hardness，Warner-Bratzler shear force and sensory value

将回归方程1、2和3联立求解，对各自变量求导，得到茶叶嫩化牦牛肉炖制的最佳工艺条件为温度100°C，时间79.8 min，茶叶用量3.88%.在此条件处理下，牛肉剪切力预测值为10.71 kg，硬度预测值为4.24 kg，感官评分为91.63.

为了验证试验的可靠性，用试验所得到的最佳条件来处理牦牛肉，重复三次，测定硬度值、剪切力值并进行感官评价，最终得到的结果为:硬度值为3.98 kg，剪切力值为11.23 kg，感官得分为92.实际值与预测值吻合良好，模型准确可靠，证明本试验确定的最佳条件能有效地嫩化牦牛肉.

2.2.2 对照组与响应面优化组的比较

(1) 对照组与响应面优化组色差的比较

在此条件下得到的牦牛肉色泽也较好(见表5)，和对照组相比，亮度值(L)显著降低(p＜0.01)，红度值(a)显著升高(p＜0.01)，黄度值(b)略有降低(p＞0.05)，整体颜色感官较好.

表5 茶叶嫩化牦牛肉优化组与对照组色泽的比较Table 5 Comparison of color difference of yak meat between control and optimization group

(2) 对照组与响应面优化组风味物质的比较牦牛肉样品中风味成分的测定结果如表6所示.

表6 优化组与对照组风味物质种类及相对含量的比较Table 6 Comparison of volatile flavor compounds and contents between control and optimization group

由表6可见，优化组牦牛肉的挥发性风味物质比对照组多9种，其中醇类多2种，酮类多1种，酸类多1种，酯类多3种，杂环多1种.在牦牛肉的风味物质中，醛类物质的种类最多，对牦牛肉风味起着重要的作用，优化组醛类物质的相对含量比对照组增加了约9%.据报道[20]，酯类物质在肉品风味中起着重要的作用，在优化组中，酯类物质的种类和含量高于对照组.由此可见，在牦牛肉的炖制中，加入茶叶能明显提高风味，使得牦牛肉的风味更加浓郁、醇厚，而且，经感官评定，加入茶叶炖制牦牛肉可有效降低牦牛肉的腥味，使得其整体风味更加协调.

3 结论

本实验采用响应面法对茶叶嫩化牦牛肉进行研究，发现对牦牛肉剪切力的影响顺序为温度、茶叶用量、时间，由回归方程确定的最佳嫩化工艺条件为:温度100°C，时间79.8 min，茶叶用量3.88%.此条件下，硬度、剪切力和感官评分的预测值分别为:4.24 kg、10.71 kg和91.63.通过验证，模型准确可靠，与试验拟合良好.而且，炖制牦牛肉时加入茶叶不仅可以起到嫩化作用，还可改善其色泽和风味，从而提高牦牛肉的食用品质.茶叶嫩化牦牛肉工艺的优化，为牦牛肉加工工艺的发展提供了一定的参考，具有很强的实用价值.

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