苦马豆素对胶质瘤细胞U87凋亡及HSP90/AKT通路的影响

童军卫，刘补兴，胡小铭，李 烨，刘正敏，蔡清风*

0 引言

胶质瘤(Glioma)是源自神经上皮的恶性肿瘤，是颅内发病率和致死率最高的恶性肿瘤，其发病机制尚不清楚[1]。目前，手术、放疗、化疗是恶性肿瘤治疗的主要手段，然而胶质瘤生长迅速，呈浸润性生长，手术治疗难以切除癌变组织，而且放疗和化疗药物毒副作用大，容易产生耐药性。因此，采用安全有效的药物治疗胶质瘤已经成为研究的热点问题。近年来，植物来源的药物已经广泛应用于肿瘤的治疗中。苦马豆素(Swainsonine，SW)是澳洲学者Colegate从灰苦马豆(Swainsonacanescens)分离得到的主要提取成分，苦马豆素作为抗癌天然小分子药物，被广泛应用于食道癌、胃癌和肝癌的基础研究中[2-4]。研究表明，苦马豆素能够抑制肿瘤细胞生长转移、诱导细胞凋亡，同时还能提高机体免疫力，增强对肿瘤细胞的抵抗能力[5]。然而苦马豆素对胶质瘤细胞U87凋亡及其相关作用机制方面的研究尚未见报道。本研究旨在利用人胶质瘤细胞系U87，阐明苦马豆素对胶质瘤细胞U87凋亡及HSP90/AKT通路的影响，以探究苦马豆素抗肿瘤作用的潜在分子机制，为胶质瘤靶向药物的开发及临床治疗提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人口胶质瘤细胞U87由第四军医大学唐都医院神经外科提供。

1.1.2 主要试剂及仪器 苦马豆素购自陕西杨陵大正生物技术有限公司。RNA提取试剂盒和反转录试剂盒购自天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶购自NEB公司；鼠抗人caspase 3多克隆抗体、鼠抗人HSP90多克隆抗体和鼠抗人AKT多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；BD-FAC Scan流式细胞仪购自美国BD公司；3K15超低温离心机购自德国Sigma公司；SW-CJ-2D2G2F2FD双人净化工作台购自苏州苏净；引物序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组 将购买的U87细胞解冻复苏，按1×106/mL接种于DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)培养基中[10%胎牛血清(FBS，Life Technologies)，100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素]，置于37 ℃ 5%CO2的潮湿培养箱中培养5 d。全量更换DMEM培养基，调整细胞数目为1×106/mL接种于24孔细胞培养板(100 μL/孔)，分别加入苦马豆素使无血清培养基中苦马豆素的含量分别为0、4、8、12 μg/mL，依次命名为对照组、苦马豆素低剂量组、苦马豆素中剂量组、苦马豆素高剂量组，每组重复6孔。培养48 h。

1.2.2 U87细胞形态变化比较 培养48 h后弃去培养液，将各组细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤2～3次后，加入0.125%胰蛋白酶消化2～3 min，加入75%乙醇固定细胞，置于4 ℃下过夜，次日弃去乙醇后，用PBS漂洗细胞2～3次。加入0.5 mL胶质纤维酸性蛋白，于倒置显微镜下观察细胞形态。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 培养结束后，用PBS洗涤细胞2～3次后，用胰蛋白酶消化细胞2～3 min，加入75%乙醇于4 ℃下过夜固定细胞，用PBS漂洗细胞，置于超低温离心机2 000 r/min离心10 min，弃去上清，此过程重复2～3次；加入10 μL RNA酶在37 ℃下孵育30 min，用10 μL PI进行染色，然后在黑暗中4 ℃孵育30 min。使用BD-FAC Scan流式细胞仪进行数据采集和分析。使用ModFit LT软件进行凋亡细胞百分比计算。

1.2.4 qRT-PCR检测caspase 3、HSP90、AKT基因表达情况 离心收集各组U87细胞，用RNA提取试剂盒提取总RNA，用反转录试剂盒将RNA反转呈cDNA。然后根据NCBI上提交caspase 3、HSP90、AKT的cDNA序列设计引物。caspase 3：上游引物F：5′-GGAAGCGAATCAATGGACTC-3′，下游引物R：5′-CTCAGAAGCACACAAACAAAA-3′；HSP90：上游引物F：5′-GGAATTGGAATGACCAAGGC-3′，下游引物R：5′-AGCAGAATGTGACTCGAGCA-3′；AKT：上游引物F：5′-CGGCAGGACCGAGC-3′，下游引物R：5′-TTGAAGAATTTGGAGGGAAGG-3′，进行qRT-PCR，同时以GAPDH为内参。PCR的反应体系为：5X缓冲液10 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，上游引物F 2 μL，下游引物R 2 μL，10 mmol dNTP mix 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 33 μL；PCR的反应条件为：预变性：95 ℃ 5 min，变性：95 ℃ 30 s，延伸：63 ℃ 15 s(caspase 3、HSP90、AKT和GAPDH)，40个循环，延伸时读取光密度(D)值。采用最大二阶导数法(2-△△Ct)对数据进行统计。△△Ct=(实验组目的基因Ct平均值-实验组内参基因Ct平均值)-(对照组目的基因Ct平均值-对照组内参基因Ct平均值)。

1.2.5 Western blot检测caspase 3、HSP90、AKT蛋白表达情况 培养48 h后收集细胞，按每1×106个细胞加入0.5 mL细胞裂解液[150 mmoL/L NaCl，1.0% NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS，50 mmoL/L Tris(pH 8.0)]提取细胞总蛋白，以GAPDH为内参，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，每孔上样体积20 μL，电泳结束后，半干转膜仪转膜50 min，分别滴加鼠抗人caspase 3、HSP90、AKT多克隆抗体，置于4 ℃下过夜，滴加二抗，37 ℃放置1 h。加入ECL发光剂进行显影，利用自动凝胶成像系统采集图像。

2 结果

2.1 U87细胞形态变化比较 培养48 h后，对照组U87细胞形态多样，大小不一，胞体上有突起，向周围延伸，且染色质均匀分布，结果见图1a；苦马豆素组细胞的数量明显减少，细胞稀疏生长，细胞和细胞核体积明显缩小，细胞质浓缩，细胞内染色质固缩，有的细胞出现凋亡小体；且随着苦马豆素剂量的增加，U87细胞形态变化越明显，结果见图1b～图1d。

图1 苦马豆素对U87细胞形态的影响

2.2 流式细胞术检测细胞凋亡 胶质瘤细胞U87经不同浓度苦马豆素(4、8、12 μg/mL)处理后，苦马豆素中剂量组和苦马豆素高剂量组细胞凋亡率明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着苦马豆素剂量增加，U87细胞的凋亡率增加，呈现剂量依赖性，结果见图2。

图2 苦马豆素对U87细胞凋亡的影响

注：与对照组比较，*P<0.05；与苦马豆素低剂量组比较，#P<0.05;与苦马豆素中剂量组比较，△P<0.05

2.3 qRT-PCR检测caspase 3、HSP90、AKT基因表达情况 胶质瘤细胞U87经不同浓度苦马豆素(4、8、12 μg/mL)处理后，苦马豆素中剂量组和苦马豆素高剂量组caspase 3 mRNA的表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着苦马豆素剂量增加，caspase 3 mRNA的表达水平显著提高，呈现剂量依赖性，结果见图3。

胶质瘤细胞U87经不同浓度苦马豆素(4、8、12 μg/mL)处理后，苦马豆素中剂量组和苦马豆素高剂量组HSP90 mRNA、AKT mRNA的表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着苦马豆素剂量增加，HSP90 mRNA、AKT mRNA的表达水平显著降低，呈现剂量依赖性，结果见图4。

图3 qRT-PCR检测caspase 3基因表达情况

注：与对照组比较，*P<0.05；与苦马豆素低剂量组比较，#P< 0.05;与苦马豆素中剂量组比较，△P<0.05

图4 qRT-PCR检测HSP90、AKT基因表达情况

注：与对照组比较，*P<0.05；与苦马豆素低剂量组比较，#P< 0.05;与苦马豆素中剂量组比较，△P<0.05

2.4 Western blot检测caspase 3、HSP90、AKT蛋白表达情况 胶质瘤细胞U87经不同浓度苦马豆素(4、8、12 μg/mL)处理后，苦马豆素中剂量组和苦马豆素高剂量组caspase 3蛋白的表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着苦马豆素剂量增加，caspase 3蛋白的表达水平显著提高，呈现剂量依赖性，结果见图5。

图5 Western blot检测caspase 3蛋白表达情况

注：与对照组比较，*P<0.05；与苦马豆素低剂量组比较，#P< 0.05;与苦马豆素中剂量组比较，△P<0.05

胶质瘤细胞U87经不同浓度苦马豆素(4、8、12 μg/mL)处理后，苦马豆素中剂量组和苦马豆素高剂量组HSP90、AKT蛋白的表达水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着苦马豆素剂量增加，HSP90、AKT蛋白的表达水平显著降低，呈现剂量依赖性，结果见图6。

图6 Western blot检测HSP90、AKT蛋白表达情况

注：与对照组比较，*P<0.05；与苦马豆素低剂量组比较，#P< 0.05;与苦马豆素中剂量组比较，△P<0.05

3 讨论

苦马豆素是从植物中提取的一种吲哚里西啶生物碱，具有突出的抗肿瘤作用。研究表明，苦马豆素通过抑制肿瘤细胞表面糖蛋白的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长和转移，诱导癌细胞凋亡[6-7]。Dennis[8]研究表明，苦马豆素能够抑制结肠肿瘤的生长。Seftor等[9]研究表明，苦马豆素可以抑制肿瘤细胞Ⅳ型胶原酶的表达，阻止肿瘤细胞浸润、转移。吴达等[10]研究表明，低浓度的苦马豆素就可以诱导肿瘤细胞相关基因上调或下调表达，进而诱导肿瘤细胞凋亡，苦马豆素还可以通过诱导内质网凋亡途经实现人胃癌细胞SGC-7901、人食道癌Eca-109细胞、肝癌细胞等的凋亡[11]。You等[12]研究表明，苦马豆素能促进肝癌细胞HepG2凋亡，de-Freitas-Junior等[13]研究表明，苦马豆素能促进结肠癌HTC-116细胞凋亡。以上结果证实，苦马豆素能抑制肿瘤细胞的生长和转移、诱导癌细胞凋亡。本研究表明，苦马豆素会引起胶质瘤细胞U87形态的变化，诱导细胞凋亡，且随着苦马豆素剂量的增加，U87细胞的凋亡率显著增加，与上述研究结果一致。

半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)家族与细胞凋亡密切相关，细胞凋亡的关键是caspase被激活，当caspase的活性受到抑制时，就会引起肿瘤的发生[14-15]。caspase家族有16个成员，caspase 3是凋亡的主要参与成分。caspase 3能特异性切割DNA，使染色质凝聚、核酸酶激活，进而导致细胞凋亡。郑爱秋等[16]研究表明，caspase 3在癌组织中通过促进癌细胞凋亡而使恶性程度降低；Hay等[17-18]研究表明，重组蛋白IAP可以下调caspase 3或caspase 7的表达，阻止细胞凋亡；然而苦马豆素对胶质瘤细胞U87中caspase 3表达水平的影响尚未见报道。本研究表明，胶质瘤细胞U87经苦马豆素处理后，caspase 3表达水平升高，且随着苦马豆素剂量增加，caspase 3表达水平显著提高，呈剂量依赖性，进一步证实苦马豆素能够诱导胶质瘤细胞U87的凋亡。

热休克蛋白(Heat shock protein 90，HSP90)作为一种分子伴侣能够参与各种信号转导通路，如细胞生长、周期调控和细胞存活等，并与通路中的关键分子相互作用，通过与底物蛋白活性部位的结合，使其维持正常的功能[19]。近年研究表明，运用HSP90抑制剂，可以提高细胞的凋亡率，提示HSP90能够促进细胞存活、抑制细胞凋亡[20]。丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Serine threonine kinase，AKT)是原癌基因v-Akt的同源物，参与caspase 3的活化[21]。AKT能够参与许多细胞的信号转导通路，如：PI3K/AKT、DNA-PKcs/Akt、Epac/Akt等，这些信号通路与细胞的生长、细胞周期以及调控细胞凋亡等密切相关，且AKT是信号转导通路中的关键蛋白。AKT是HSP90的底物蛋白，研究表明,HSP90能够与AKT结合，阻止AKT的去磷酸化，保护AKT的活性功能不丧失[22]。Shaknovich等[23]研究表明,AKT的活化需要AKT与HSP90及伴侣分子Cdc37组成复合物，HSP90的伴侣功能对于维持该复合体的存在至关重要。Li等[24]研究表明，HSP90/Akt信号通路能够诱导脓毒症小鼠心肌细胞中caspase 3的活化，进而诱导心肌细胞的凋亡；Gong等[25]研究表明，海兔素通过抑制HSP90/Akt信号通路中相关蛋白(HSP90和Akt)的表达水平，进而诱导胶质瘤细胞GL26凋亡；Maria等[26]研究表明，用HSP90和Akt抑制剂靶向抑制信号通路PI3K/Akt/HSP90，可以促进人胃癌细胞凋亡。以上研究均提示，HSP90/Akt信号通路与细胞凋亡密切相关。虽然国内外对HSP90、AKT及HSP90/AKT信号通路方面均进行了初步研究,但是苦马豆素对于胶质瘤细胞HSP90/AKT信号通路的影响尚未见报道。本研究表明,苦马豆素能够抑制HSP90/AKT信号通路中HSP90和AKT蛋白的表达，促进胶质瘤细胞的凋亡，且随着苦马豆素剂量增加，胶质瘤细胞U87凋亡水平显著升高，呈剂量依赖性，推测苦马豆素促进胶质瘤细胞U87凋亡的机制是通过抑制HSP90/AKT信号通路的活性来实现的。

综上所述，苦马豆素能够抑制HSP90/AKT信号通路中HSP90和AKT蛋白的表达，促进胶质瘤细胞U87凋亡，为胶质瘤的临床治疗和胶质瘤靶向药物的开发提供一定的理论基础。

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