考马斯亮蓝法测定复方白及乳膏中植物蛋白的含量

陶平德陈芳(通讯作者)雷敏常明泉陈林

（1十堰市太和医院 湖北 十堰442008）（2湖北医药学院药学院学生 湖北 十堰442000）

复方白及乳膏是太和医院2013年立项资助的科研项目，也是该院2016年立项的前沿技术项目。该乳膏以白及溶胶[1]为主药，加基质经乳化而成， 具有清除皮肤自由基、软化角质、促进细胞生长、抗氧化、保湿润肤的功效，用于治疗干性皮炎、皮肤皲裂、黄褐斑，也可用于鱼鳞病、银屑病的辅助治疗[2-3]。

复方白及乳膏能使黄褐斑减退并抑制其生长，可能与其含有一定量的植物蛋白有关，前期，笔者以白及多糖为指标，对该乳膏的质量控制、体外释放度等内容做过一些相关研究，为进一步明确其活性成份和药理作用，更好的控制复方白及乳膏质量、为开展后续研究奠定基础，作者试验用考马斯亮蓝染色法对其中的植物蛋白含量进行检测。

1.仪器及试药

1.1 仪器

TU-1901型分光光度仪（北京普析通通用仪器有限责任公司）；BCD-610W型冰箱（博西华家用电器有限公司,功率：1.07KW）；KM-410C型超声震荡仪（广州市科洁盟实验仪器有限公司，40KHZ）；WGA-UNI-10型超纯水器（北京普析通仪器有限责任公司，功率：300W）；FA-2004型电子分析天平（上海精密仪器有限公司，精度0.0001g）；MH-1000型电热套（北京科伟永兴仪器有限公司，300W）；试管架（江苏新康医疗器械有限公司，13×50）；玻璃试管（20mL、10mL）。

1.2 试药

复方白及乳膏（太和医院生产，批号：20170322，20170410，20170416）；牛血清蛋白标准品(中国食品药品检定研究院，批号140619-201622,包装规格23.5mg/瓶)；考马斯亮蓝G250（成都艾科达化学试剂有限公司，CBB，批号6401-58-1）；无水乙醇（武汉市中天化工有限责任公司，批号20161225，分析纯）；85%磷酸（武汉市中天化工有限责任公司，批号20161212，分析纯）；NaCl（沈阳试剂厂,批号2016010599，含量95～100.05%，基准试剂）；纯化水（太和医院新鲜生产）。

2.方法与结果

2.1 溶液的制备

（1）0.15mol·L-1Nacl溶液。精密称取0.4387gNaCl于50mL容量瓶中，加纯化水溶解，定容,即得。（2）考马斯亮蓝溶液。精密称取考马斯亮蓝G-25050mg溶于25mL乙醇中，加入85%磷酸50mL，混合，加纯化水稀释至500mL，即得。（3）标准蛋白溶液。精密称取牛血清蛋白标准品10mg，置10mL容量瓶中，加纯化水溶解，定容，即得1.0mg·mL-1标准蛋白对照品储备液，置冰箱中低温保存（4℃），取该溶液0.2mL于试管中，加0.15mol·L-1Nacl溶液至2.0mL，加入考马斯亮蓝溶液10.0mL，混匀，在室温放置5min，即得。（4）供试品溶液。精密称取复方白及乳膏0.25g于烧杯中，加无水乙醇约20mL，超声溶解，过滤至50mL容量瓶中，用无水乙醇洗涤烧杯3次（每次约8mL），集中滤液，用无水乙醇定容，取该溶液0.6mL于试管中，加0.15mol·L-1Nacl溶液至2.0mL,加入考马斯亮蓝溶液10.0mL，混匀，放置5min，即得。（5）空白溶液的制备。精密吸取纯化水2mL于试管中，加入考马斯亮蓝溶液10.0mL混匀，在室温放置5min，即得。

2.2 测定波长的选择

分别取“2.1”项下的标准蛋白溶液、供试品溶液和空白样品溶液，在分光光度仪上于500～700nm波长处扫描，记录扫描图，结果，标准蛋白溶液、供试品溶液均在595nm处均有最大吸收，空白样品溶液在此波长处无吸收，选择595nm为测定波长，扫描图见图1。

图1 紫外扫描图

2.3 曲线方程的建立

分别精密吸取“2.1”项下浓度为1.0mg·mL-1标准蛋白储备溶液0.2mL，0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL于10mL试管中，每管加0.15mol·L-1Nacl溶液至1.0mL，混匀，各取0.1mL于对应编号的新试管中，分别加入考马斯亮蓝溶液5.0mL混匀，室温放置5min，即得毎mL含标准蛋白为3.92μg、7.84μg、11.76μg、15.69μg、19.61μg的溶液,取各溶液分别在595nm波长处测定吸收度，以浓度为横坐标，吸收度值为纵坐标，绘制标准曲线，得曲线方程为y=0.036x-0.0005，r=0.9995,标准蛋白在3.92μg·mL-1～19.61μg·mL-1范围内呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

取“2.1”项下的标准蛋白溶液，以相应试剂为空白，在595nm波长处连续测定5次，记录吸光度值，结果RSD为0.77%。表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取“2.1”项下的标准蛋白溶液在595nm波长处分别于0,1,3，6h测定吸光度，记录吸光度值，结果RSD为1.89%，表明标准蛋白溶液在6h内稳定。

2.6 重复性试验

平行精密称取复方白及乳膏0.25g于试管中，共5份，按“2.1”项下供试品溶液的方法制备样品溶液，以相应试剂为空白，在595nm波长处测定吸光度，计算含量，结果RSD为1.34%。

2.7 回收率试验

精密称取已测知含量的复方白及乳膏（批号20170410）0.125g共9份，毎3份为1组，分别按样品含量的80%、100%、120%加入标准蛋白溶液，按“2.1”项下供试品溶液制备方法制备溶液，以相应试剂为空白，在595nm波长处测定吸光度，计算回收率，结果见表1。

表1 复方白及乳膏中植物蛋白回收率实验表（n =9）

2.8 含量测定

精密称取复方白及乳膏0.25g（批号为20170322，20170410，20170416）于烧杯中，每个批号各3份，按“2.1”项下的方法制备供试品溶液，以相应试剂为空白，在分光光度仪上于595nm处分别测定吸收度，计算含量，结果见表2。

表2 复方白及乳膏中植物蛋白含量测定结果（n=3）

3.讨论

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，与蛋白质发生特异性结合后呈蓝色，在595nm波长处有最大吸收,在一定范围内，蛋白质与染色剂的结合量与测定波长的吸光度值成正比，因而采用考马斯亮蓝染色法测定复方白及乳膏中的植物蛋白含量。在制备供试品溶液时，曾使用纯化水、10%NaL溶液、乙醇-氯仿（1:1）混合液做乳膏的溶剂，超声处理，对液体分别应用离心、过滤等方法，但效果都不理想，而采用无水乙醇做溶剂，则溶解效果好，溶解速度快，所制备的溶液澄清，检出效果良好。作者曾考虑到植物蛋白在酸、碱、丙酮、乙醇中会受到影响。是否因为植物蛋白表面有一层纤维膜，对氨基酸结构具有保护作用？值得进一步验证探讨。

复方白及乳膏中的蛋白属于植物蛋白，成份比较复杂，里面不仅有多糖、植物蛋白，还有植物色素等物质，植物色素可能也产生一定的光密度值，所以在配制样品时应使蛋白质浓度在0.1mg.mL-1以内，必要时适当增加考马斯亮蓝染色液的用量，以保证与蛋白质染色反应完全，克服其它成份对蛋白质测定产生的影响。酸碱对植物蛋白的测定会有一定影响，配制检测溶液时加入0.15mol·L-1NaCl溶液稀释，可缓冲其影响。在测定实验之前应把本实验所用器具用铬酸钾清洁液浸泡、用纯化水清洗干净，并避免使用石英吸收池，防止用具不洁对测定结果产生干扰，每次测定完毕用乙醇清洗比色皿，然后用纯化水清洗，以免考马斯亮蓝染色液在比色皿上存在残留。

【参考文献】

[1]李玲,常明泉.天然高分子复方白及乳膏的制备及质量控制[J].海峡药学,2015,27(1):51-53.

[2]何秀丽,陈林,常明泉,等.复方白及乳膏治疗手足皲裂的疗效观察[J].2013,21（6）:648-650.

[3]黄汉陵，汪移林，王刚.自制复方白及乳膏治疗Ⅲ型足部皲裂86例疗效观察[J]．山东医药，2014,53（31）：105-106.