固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中克伦特罗残留量及条件优化

(镇江市产品质量监督检验中心，镇江 212132)

克伦特罗(Clenbuterol)既不是兽药，也不属于添加剂，而是一种激素类物质，俗称“瘦肉精”，该物质能促进动物体内脂肪分解代谢，增加蛋白质合成，提高瘦肉率，然而人体食用高残留量的内脏组织或者累计摄入量超过一定值时便可能引发食物中毒事件[1-3]。1997 年我国明令禁止在畜牧行业生产、销售和使用克伦特罗，但是非法使用克伦特罗的事件仍时有发生[4]。

现行有效的标准中测定克伦特罗的方法有酶联免疫法、胶体金免疫层析法、液相色谱法和质谱法[5-8]，针对不同的样品基质和实验室条件可以选择合适的测定方法。国家标准GB/T 22944—2008中采用液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中克伦特罗的残留量[9]，该方法对仪器条件要求较高，而关于高效液相色谱法测定蜂蜜中克伦特罗的文献并不多见，于是尝试建立固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中克伦特罗的方法并对测试条件进行优化。

1 实验方法

1.1 仪器和试剂

Waters e2695液相色谱仪(主要包括2998光电二极管矩阵检测器，柱温箱，自动进样器，自动脱气四元梯度泵等，美国Waters公司)；微型漩涡混合仪(上海沪西分析仪器厂)；12位固相萃取真空装置(上海安谱实验科技股份有限公司)；12位干浴氮吹仪(上海安谱实验科技股份有限公司)； Millpore超纯水系统(美国Millpore公司)。

甲醇中盐酸克伦特罗标准溶液(250μg/mL，北京坛墨质检科技有限公司)；甲醇、乙酸乙酯和乙酸为色谱纯(美国Tedia公司)；无水乙醇、盐酸、乙酸钠、乙酸铵、磷酸二氢钠、氨水和磷酸为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)；实验用水为Millpore超纯水系统制得，18MΩ·cm，25 ℃；CNWBOND WCX(500mg，6mL)、CNWBOND SCX(500mg，6mL)、CNW Poly-Sery MCX(60mg，3mL)和CNW Poly-Sery HLB(500mg，6mL) 固相萃取柱(上海安谱实验科技股份有限公司)；Oasis MCX(60mg，3mL)和Oasis HLB(200mg，6mL)固相萃取柱(美国Waters公司)。

1.2 色谱条件

色谱柱：CNW Athena C18-WP (250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇：磷酸二氢钠(0.02mol/L)=40∶60；流速：1.0mL/min；进样体积：20μL；柱温：30℃；检测波长：210nm。

1.3 样品前处理

称取约2g蜂蜜样品于50mL离心管中，加入20mL乙酸钠缓冲溶液(0.2mol/L，pH=5.0)，漩涡混匀，蜂蜜完全溶解后备用，待净化。

采用不同填料的固相萃取柱进行净化，固相萃取柱填料不同，活化和净化方法也有所区别，具体实验方法如下：

(1)WCX固相萃取柱

依次用5mL乙醇和5mL水活化固相萃取柱，将上述蜂蜜提取液全部转移至活化后的固相萃取柱中，分别用5mL水和5mL 乙醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，真空抽干2min，最后用10mL氨水-乙醇溶液(体积比2∶98)进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在50℃下氮气吹干，准确加入1mL水溶解残渣，过0.22μm滤膜后进样测定。

(2)SCX固相萃取柱

依次用5mL甲醇、5mL水和5mL 0.03mol/L盐酸溶液活化固相萃取柱，将上述蜂蜜提取液全部转移至活化后的固相萃取柱中，分别用5mL水和5mL甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，真空抽干2min，最后用10mL氨水-甲醇溶液(体积比5∶95)进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在50℃下氮气吹干，准确加入1mL水溶解残渣，过0.22μm滤膜后进样测定。

(3)MCX固相萃取柱

依次用3mL甲醇、3mL水和3mL 0.1mol/L盐酸溶液活化固相萃取柱，将上述蜂蜜提取液全部转移至活化后的固相萃取柱中，分别用3mL 0.1mol/L盐酸溶液、3mL水和3mL50%甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，真空抽干2min，最后用5mL氨水-甲醇-乙酸乙酯溶液(体积比5∶45∶50)进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在50℃下氮气吹干，准确加入1mL水溶解残渣，过0.22μm滤膜后进样测定。

(4)HLB固相萃取柱

依次用5mL甲醇和5mL水活化固相萃取柱，将上述蜂蜜提取液全部转移至活化后的固相萃取柱中，分别用5mL水和5mL甲醇淋洗固相萃取柱，弃去淋洗液，真空抽干2min，最后用10mL氨水-甲醇溶液(体积比5∶95)进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液在50℃下氮气吹干，准确加入1mL流动相溶解残渣，过0.22μm滤膜后进样测定。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的确定

采用Waters 2998二级管阵列检测器的3D扫描功能，在波长190～400nm范围内对高浓度的克伦特罗标准工作溶液进行测定，并在克伦特罗出峰位置提取光谱图，见图1。从图1中可以看出，克伦特罗的最大吸收波长在210nm附近，因此选择210nm作为检测波长，此时克伦特罗的响应值最大。

2.2 流动相对克伦特罗标准工作溶液测定的影响

以甲醇-水、甲醇-乙酸盐和甲醇-磷酸盐为流动相，从pH值、流动相比例和方法重复性3个方面考察流动相对克伦特罗标准工作溶液测定的影响。实验结果表明，以甲醇-水为流动相时，色谱图中并没有明显的克伦特罗色谱峰，当流动相中加入磷酸后克伦特罗开始出峰；随着磷酸加入量的增加，其保留时间提前并且峰高与峰面积也随着增加；当进一步提高流动相中磷酸含量时，克伦特罗的保留时间逐渐延长，但是峰面积保持不变。这是由于克伦特罗呈弱酸性，在水溶液中以离子形态存在，降低了在C18色谱柱上的保留行为，而磷酸的加入能够抑制克伦特罗的电离，使其以分子的形态存在，增加克伦特罗在C18色谱柱上的保留，并改善峰形。以甲醇-乙酸盐和甲醇-磷酸盐为流动相时，克伦特罗的电离得到抑制，峰形较好，pH值对保留时间和峰面积的影响也较小。

图1 克伦特罗标准工作溶液的3D扫描图(a)和吸收光谱图(b)

采用上述3种流动相进行测定时，改变流动相中甲醇含量对克伦特罗的保留时间和峰形具有很大的影响。随着流动相中甲醇含量的减少，克伦特罗的保留时间逐渐延长，峰宽变宽，峰高变小，方法的灵敏度变低。以甲醇-水流动相为例，当流动相pH=2.8，甲醇含量为20%时，克伦特罗的保留时间为17min左右；甲醇含量为45%时，克伦特罗的保留时间提前到3min左右，而且与溶剂峰重叠，不利于定性和定量分析，实验结果见图2。

图2 流动相比例对克伦特罗标准工作溶液测定的影响流动相中甲醇含量分别为(a).20%;(b).25%;(c).30%;(d).35%;(e).40%;(f).45%

采用Waters e2695液相色谱仪的自动进样器，吸取一定浓度的克伦特罗标准工作溶液，连续6针进样，在上述3种流动相条件下进行测试，考察方法的重复性。实验结果表明，甲醇-水流动相条件下，当流动相pH=2.8，甲醇含量为30%时，克伦特罗的保留时间不稳定，随着进样次数的增加，保留时间不断前移，6针进样后克伦特罗保留时间的相对标准偏差(RSD)值为1.3%。甲醇含量增加至40%时，虽然能够提高方法的重复性，但是保留时间较短，容易受到样品中杂质组分的干扰。甲醇-乙酸盐和甲醇-磷酸盐流动相条件下克伦特罗的保留时间稳定，连续6针进样，克伦特罗保留时间的RSD值分别为0.1%和0.3%。

2.3 流动相对蜂蜜中克伦特罗残留量测定的影响

蜂蜜及蜂蜜加标样品，经过固相萃取柱富集、净化、浓缩后，分别采用上述3种流动相进行测定，考察流动相对蜂蜜中克伦特罗残留量测定结果的影响，实验结果见图3。实验结果表明，以甲醇-水为流动相，当流动相pH=2.8，甲醇含量为40%时，蜂蜜样品提取后直接进样测定色谱图中，在克伦特罗保留时间处有一个很大的杂质峰，虽然该杂质峰经HLB固相萃取柱净化后消失，但是实际检测时该杂质峰对克伦特罗测定仍然存在隐患，如果净化不干净，就可能出现假阳性的结果，同时，在该流动相条件下，样品在2～6min内有许多杂质峰，影响克伦特罗与杂质组分之间的分离度。当流动相为甲醇-乙酸盐时，克伦特罗的测定受到杂质组分的影响很大，克伦特罗出峰时基线较高，而且与杂质组分不能基线分离；降低流动相中甲醇含量，样品中克伦特罗的灵敏度明显降低。当流动相为甲醇-磷酸盐时，克伦特罗与样品中的杂质实现基线分离，其保留时间附近的干扰组分较少，灵敏度能够满足残留量检测的要求。同时，在此色谱条件下，蜂蜜加标样品只需经过简单的提取便能直接测定，给高残留值蜂蜜样品的测定提供了便捷的方法。结合上述实验，最终选择采用甲醇-磷酸盐为流动相对蜂蜜中克伦特罗残留量进行测定。

图3流动相对蜂蜜中克伦特罗残留量测定的影响(a).甲醇-水;(b).甲醇-乙酸盐;(c).甲醇-磷酸盐

2.4 固相萃取柱对蜂蜜中克伦特罗残留量测定的影响

以甲醇-磷酸盐为流动相，测定固相萃取柱净化后的蜂蜜加标样品，考察固相萃取柱对蜂蜜中克伦特罗残留量测定的影响，实验结果见图4。从图4中可以看出，CNWBOND SCX固相萃取柱净化后杂质组分的响应值依然很大，SN/T 1924-2007中采用了C18和SCX固相萃取柱串联的方法进行净化[10]，而本实验仅采用了SCX固相萃取柱进行净化，这可能是导致杂质去除不完全的原因之一；采用其他几种固相萃取柱净化后，色谱图中杂质峰的响应值明显降低，其中采用WCX固相萃取柱净化后的色谱图中杂质少，基线比较平整。对比相同填料不同品牌固相萃取柱净化后的色谱图可以发现，两种品牌的固相萃取柱对杂质去除能力难分伯仲。

2.5 标准曲线的绘制

准确吸取1.0mL盐酸克伦特罗标准溶液于25mL容量瓶中，用水稀释成浓度为10.0μg/mL的标准储备溶液。吸取适量体积克伦特罗标准储备溶液，用水稀释配成相应浓度的标准工作溶液，并按上述选定的色谱条件进行测定。以样品峰面积Y(mV)对质量浓度X(μg/mL)作图，得到线性回归方程Y=146893X+311，相关系数R2=0.9991，结果表明：克伦特罗含量在0.10～1.00μg/mL之间时，该方法呈现良好的线性关系。

图4固相萃取柱对蜂蜜中克伦特罗残留量测定的影响(a).CNWBOND WCX;(b).CNWBOND SCX;(c).CNW Poly-Sery MCX;(d).CNW Poly-Sery HLB;(e).Oasis MCX;(f).Oasis HLB

2.6 回收率及固相萃取柱性能测定

称取约2g蜂蜜样品，共12份，往每份样品中加入0.50mL浓度为1.0μg/mL的克伦特罗标准工作溶液，样品经乙酸钠缓冲溶液提取后，分别采用上述6种固相萃取柱对样品进行净化，每种固相萃取柱做2平行，并以甲醇-磷酸盐为流动相进行测定，考察固相萃取柱的回收率，实验结果见表1。测定结果表明，6种固相萃取柱均具有较好的回收率，回收率大于85%，其中MCX和HLB固相萃取柱的回收率明显高于其他两种填料的固相萃取柱；实验中所使用的相同填料不同品牌的固相萃取柱回收率结果相近。

表1 回收率测定结果 %

3 结论

(1)本实验建立了固相萃取-高效液相色谱法测定蜂蜜中克伦特罗的方法，分别以甲醇-水、甲醇-乙酸盐和甲醇-磷酸盐为流动相，考察了流动相对测定结果的影响。实验结果表明，以甲醇-水为流动相时，流动相对pH值的缓冲能力较弱，克伦特罗的保留时间发生漂移；以甲醇-乙酸盐为流动相时，基线噪音较大，方法灵敏度低；以甲醇-磷酸盐为流动相时，方法重复性好，灵敏度较高。

(2)实验中考察了固相萃取柱填料和品牌对蜂蜜中克伦特罗残留量测定的影响。实验结果表明，固相萃取柱对蜂蜜中克伦特罗残留量的测定结果有很大的影响，4种不同填料的固相萃取柱中，MCX和HLB固相萃取柱的回收率较高，WCX和SCX固相萃取柱的回收率略低，相同填料不同品牌的固相萃取柱回收率结果相近。

[1]侯仕农,闫强,马爱民.盐酸克伦特罗的药理作用对食品安全的危害和检测技术[J].内蒙古农业科技,2006(6):29-31.

[2]杨浩峰,严蕾.盐酸克伦特罗的药理作用危害及检测[J].地方病通报,2006(1):101-104.

[3]张华.瘦肉精的危害及检测方法[J].贵州农业科学,2004(1):83- 84.

[4]陈肇臻,刘小刚.猪肝中克伦特罗的测定─反相高效液相色谱法[J].质量技术监督研究,2014,1(31):14-27.

[5]安徽省质量技术监督局.DB34/T 823-2008 动物组织中盐酸克伦特罗的残留测定—酶联免疫吸附法[S].

[6]安徽省质量技术监督局.DB34/T 818—2008饲料中盐酸克伦特罗的测定—胶体金免疫层析法[S].

[7]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 1924-2011进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法[S].北京：中国标准出版社,2011.

[8]中华人民共和国卫生部与中国国家标准化管理委员会.GB/T 5009.192-2003. 动物性食品中克伦特罗残留量的测定[S].北京:中国标准出版社,2003.

[9]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局与中国国家标准化管理委员会.GB/T 22944-2008蜂蜜中克伦特罗残留量的测定 液相色谱-串联质谱法[S].北京:中国标准出版社,2009.

[10]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T 1924-2007进出口动物源食品中克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林残留量的检测方法 液相色谱-质谱/质谱法[S].北京：中国标准出版社，2007.