牡丹籽壳中黑色素的提取及化学成分测定的方法研究

◎ 丁永霞

（菏泽市疾病预防控制中心，山东 菏泽 274010）

天然黑色素广泛存在于植物、动物和微生物中，是由吲哚或酚类化合物聚合而成的非均质高分子化合 物[1]。黑色素分为吲哚型黑色素和儿茶酚型黑色素（一种植物黑色素，也称异黑色素，呈棕色或黑色），而吲哚型黑色素又分真黑色素（如酪氨酸、二羟基苯丙氨酸、酪胺等含氮化合物）和脱黑色素（含硫大分子，如半光氨酸）。

天然黑色素是黑米、黑芝麻等黑色食品的主要活性成分，具有清除自由基、延缓衰老、增强免疫力、促进造血功能、调节血脂等特性[2]，以及滋补保健作用，是食品着色、护发与护肤的保健品所用黑色素的重要来源[3]。因此，黑色素在医药、化妆品、食品等领域有着广泛的应用前景。

黑色素既可以通过酪氨酸或其衍生物的氧化进行化学合成，也可以从动植物材料中提取，还可以利用微生物合成[4]。由于合成色素在代谢过程中常会产生有害物质，直接危害人体健康，所以，人们的关注点已从合成色素转移到如何提取天然色素以及天然色素的开发和应用上来。而传统的提取方法，如粉碎法、压榨法、有机溶剂提取法、回流法等存在着提取时间长、劳动强度大、原料预处理能耗高、热敏性组分易被破坏、生产的色素产品纯度差、有异味和溶剂残留等缺点，直接影响了天然色素的发展及应用[5]。

本实验利用生产牡丹籽油的下脚料牡丹籽壳为原料，采用超声波辅助乙醇萃取牡丹籽壳中的黑色素，提取剂用量少（料液比1 ∶9）[6]、温度低（45 ℃）、时间短（30 min）[7-8]、黑色素产率高（17.63%）[9]、节能，无溶剂残留、无污染、可避免萃取物中高温下的热裂化，保护了生理活性物质的活性，并保持萃取物的天然风味。是较先进的提取方法，目前尚未见报道。

1 实验预处理

1.1 主要仪器

ESJ180-4电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司）、KQ-600 型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）、旋转蒸发器RE-52AA（上海亚荣生化仪器厂）、SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（河南省豫华仪器有限公司）、TU-1810 PC 型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、FTIR-370 傅立叶红外光谱仪（U.S.A NICOLET）等。

1.2 主要试剂

牡丹籽壳（购自菏泽尧舜牡丹生物科技公司）、 1 mol·L-1NaOH 溶液、1 mol·L-1HCl 溶液、75%和95%的乙醇溶液、0.5 g 溴化钾。

1.3 样品的制备

将一定量的牡丹籽壳分别装入500 mL 的干燥烧杯，把它们放置在60 ℃的干燥机中干燥2 h。待干燥结束，将其放进粉碎机进行粉碎，然后过80 目筛，得到牡丹籽壳粉末。

1.4 样品的提取

1.4.1 超声波辅助萃取

用电子分析天平称取一定量（60.355 8 g）的牡丹籽壳粉末，放入洁净的三角瓶中，按料液比1 ∶9 的比例加入75%的乙醇溶液，放入超声处理器中，在温度45 ℃、超声波功率600 W 的条件下，超声提取30 min。

1.4.2 抽滤分离得到黑色素粗品

用隔膜真空压力泵抽滤分离溶剂混合物与残渣，反复提取3 次。用75%乙醇洗涤残渣2 ～3 次，合并所得滤液。然后通过旋转蒸发器，再连接循环水式真空泵（旋转蒸发器需要水浴加热至45 ℃）减压蒸馏回收溶剂，将浓缩物置干燥机烘干得到牡丹籽壳黑色素粗品。

1.4.3 热碱溶解、精品的制备

用浓度为1 mol·L-1的热氢氧化钠溶液溶解，再加入浓度为1 mol·L-1的盐酸溶液调节pH 值，至析出沉淀，最后减压、过滤、干燥得到牡丹籽壳黑色素的精品。实验所得数据见表1。

表1 温度45 ℃时黑色素的产率表

2 实验测定和结果讨论

2.1 黑色素的测定及定性分析

2.1.1 紫外-可见的测定

（1）溶液的配制。①一组。准确称取0.01 g 的黑色素精品，放入10 mL 的比色管，再加入1 mol·L-1的NaOH 溶液至刻度（10 mL），将其充分溶解，得到浓度为1 mg·mL-1的黑色素（NaOH）溶液，编号为A；依次将A 管中的溶液稀释10 倍，分别得到浓度为 0.1 mg·mL-1（B 管）、0.01 mg·mL-1（C 管）的黑色素 （NaOH）溶液；同时，向一个空白比色管中加入 10 mL 的1 mol·L-1的NaOH 溶 液 作 为 空 白 溶 液，编号为D。②二组。准确称取0.01 g 的黑色素精品，放入10 mL 的比色管，再加入95%的乙醇溶液至刻度线 （10 mL），将其充分溶解，得到浓度为1 mg·mL-1的黑色素（乙醇）溶液，编号为①；依次将①管中的溶液稀释10 倍，分别得到浓度为0.1 mg·mL-1（②管）、0.01 mg·mL-1（③管）的黑色素（乙醇）溶液；同时。向一个空白比色管中加入10 ml 的乙醇溶液，作为空白溶液，编号为④。

（2）光谱扫描进行光谱分析。用紫外-可见分光光度计做光谱扫描测定黑色素的吸收波长。将B、D比色管作为第一组，②、④比色管作为第二组，按组次的顺序同时放入紫外可见分光光度计，测得光谱图形见图1、图2，数据见表2、表3。

图1 0.01 mg·mL-1 黑色素（NaOH）溶液光谱扫描图谱图

图2 0.01 mg·mL-1 黑色素（乙醇）溶液光谱扫描图谱图

表2 黑色素（NaOH）溶液的吸收波长及其吸光度表

表3 黑色素（乙醇）溶液的吸收波长及其吸光度表

由紫外谱图可知，黑色素的化学成分里含有N 元素，因为-N=N的吸收波长在340 nm附近，而不含S元素，是因为=C=S 的吸收波长在500 nm 附近，且可以推断出其化学结构式中含有-COOH、苯环等官能团。

2.1.2 红外吸收光谱的测定

用压片法进行红外光谱测定。将一定量的溴化钾和黑色素精品放在105 ℃的干燥箱中烘干1 h。准确称取0.500 0 g 的溴化钾、0.005 0 g 的黑色素精品（溴化钾99%、黑色素精品1%），将其混合放入玛瑙研钵中进行充分研磨，研磨后，再放入机械式半自动压片机进行压片，压片效果为透明状，则证明已压片结束。

将压好的片旋下，放入红外光谱仪进行测定，得到红外光谱图如图3 所示。从红外光谱图3 来看实验制得的样品在一定的共振区域与真黑色素有相近的吸收峰，说明他们可能具有以下相同的结构：①含有-OH 或-NH2，-NH（游离）的结构。样品在 3 379.47 cm-1附近有较强的吸收峰。②含有苯环外-C-H 结构。样品在3 009.99、2 926.32、2 854.81 cm-1附近都存在较强的共振吸收峰可能是指示含有苯环外-C-H 结构的存在。③含有-C=O 结构。样品在1 709.87 cm-1附近的吸收指示-C=O 的伸缩振动。④含有苯环结构。样品在1 608.25、1 512.85、1 458.81 cm-1附近都存在较强的共振吸收峰，可能是有苯环。

图3 黑色素红外扫描光谱图

2.2 结果分析

2.2.1 实验条件的讨论

在实验过程中，笔者做了许多相关实验，研究了处理温度、萃取时间、料液比等因素对黑色素提取率的影响，结果见表4 ～表6。

由表4 可确定，超声萃取黑色素的最佳处理温度为45 ℃。

由表5 可知，超声萃取的最佳时间为30 min。

由表6 可以确定，超声萃取选取的最佳料液比为1 ∶9。

表4 不同温度对黑色素产率的影响表

表5 不同萃取时间对黑色素产率的影响表

表6 不同料液比对黑色素产率的影响表

通过反复的正交实验，最终确定了实验的最佳条件为：温度45 ℃，萃取时间30 min，料液比1 ∶9。

2.2.2 实验结果分析

通过紫外和红外的测定，可对牡丹籽壳中的黑色素做出定性分析，其属于真黑色素的一种。因为真黑色素和脱黑色素最大的区别就是，脱黑色素的分子结 构式中含有S 元素。由于实 验仪器有限，所以推断其分子结构式可能与 相似。

3 社会效益和经济效益分析

3.1 实验过程中所用仪器的用电量的成本计算（电费按大型工厂计算）

①高速万能粉碎机的电机功率0.2 kW，其工作时间为3 h，可以计算出所用的电量=0.2×3=0.6 kW·h。②电热恒温鼓风干燥机的额定功率6 kW，其工作时间为9 h，可以计算出所用的电量=6×9=54 KW·h。③超声波清洗器的超声电功率0.6 kW，其工作时间为1.5 h，可以计算出所用的电量=0.6×1.5=0.9 kW·h。④旋转蒸发器的额定功率1 kW，其工作时间为12 h，可以计算出所用的电量=1×12=12 kW·h。⑤循环水式真空泵的额定功率0.18 kW，其工作时间为12 h，可以计算出所用的电量=0.18×12=2.16 kW·h。

以上5 种仪器所用的总电量=0.6+54+0.9+12+2.16= 69.66 kW·h，由于实验过程中还用其他仪器进行操作，大体估算完成本实验所用的总电量为72 kW·h，所以应缴纳的电费为72×1.1=79.2 元。

3.2 实验过程中所用材料的成本计算

市面上500 mL 95%的乙醇的价格为6.5 元/瓶，而此次实验所用的为75%乙醇，需要自己进行配制，可以计算出每500 mL 的75%乙醇需要约395 mL 的95%乙醇进行配制，最后可以算出75%乙醇的单价=6.5/500×395=5.135 元，可以估算为500 mL 75%的乙醇的价格为5.5 元/瓶。本次实验75%乙醇的用量约2瓶（5.5×2=11 元），但其可蒸馏回收循环使用，节省了很多成本。生产牡丹籽油后的牡丹籽壳0.1 元/kg；加上工时等确定本次实验约成本为100 元，黑色素精品质量为10.640 8 g，每产出1 g 黑色素，需要成本约10 元。牡丹黑色素按100 元/g 计，每克毛利润90 元，产出每吨毛利润9 000 万元。由于黑色素所应用的领域较为广泛，所以牡丹籽壳提取出的黑色素，一旦进行大规模生产，将为菏泽企业带来很高的经济效益。若用牡丹黑色素开发出天然的牡丹草本润黑露，将填补国内空白，为国家节省大量外汇，使菏泽企业产生巨大的社会效益。

4 结论

本实验以超临CO2萃取牡丹籽油后的牡丹籽壳为原料，利用高新技术超声辅助提取其中的黑色素，研究了液料比、处理温度、萃取时间等因素对黑色素提取率的影响，制定出超声辅助提取黑色素的工艺条件，测定出其化学成分。而实验的创新点在于超声波辅助提取黑色素比常规回流溶剂用量少（料液比1 ∶9，常规回流1 ∶30）、时间短（30 min，常规回流一次需 6 ～12 h）、温度低（45 ℃，常规回流需60 ～70 ℃）、产率高（精品产率大于5.0%，常规回流只有1.4%，因温度高黑色素易被氧化）、设备投资少。因牡丹籽承载神州七号飞船后，是唯一不发生变异的种子，说明其壳对于紫外线的吸收强，抗辐射能力强。通过紫外吸收光谱分析，其含有的青花芍药苷在280 ～360 nm有强的吸收。所以黑色素的研究领域存在很大的潜力，一旦牡丹籽壳黑色素投放市场，会受到社会上很多企业的青睐。