左旋含羞草碱诱导骨肉瘤细胞凋亡作用及机制的体外实验研究

江哲珍 祝少博*余黎 汪冰 邓玲珑 魏驰

骨肉瘤是青少年和儿童常见的原发恶性骨肿瘤，其临床特点是转移早、预后差、生存率低等[1]。近年来，新辅助化疗的开展与应用使患者生存率由之前的15%左右提高到80%左右[2]，但现有化疗药物的毒副作用较大，部分患者因为无法坚持完成化疗而导致肿瘤出现转移或者复发，治疗效果得不到提高[3,4]，这一现象引起了临床医生和肿瘤研究者的极大关注和重视。研究新型、高效低毒的抗肿瘤药物，对改善骨肉瘤患者的预后具有重要的意义，现已成为骨肉瘤治疗研究的重点之一。

左旋含羞草碱（L-Mimosine）是一种从含羞草或银合欢中提取出来的少见的植物氨基酸，分子量大小为198.2。左旋含羞草碱的化学结构较特殊，与胸腺嘧啶极其相似，但作用不同于目前常用的化学治疗药物[5,6]。研究发现左旋含羞草碱能够可逆性抑制哺乳动物的细胞周期，主要在G1/S期起作用，影响细胞DNA复制的启动及复制链的延长[7]。已有研究发现左旋含羞草碱能够抑制多种肿瘤细胞的生长增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，但左旋含羞草碱作用的确切机制尚不清楚[8-10]。本研究主要探讨左旋含羞草碱对骨肉瘤细胞的作用，并初步探讨其中的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

骨肉瘤细胞系MG-63和U2-OS购自中国典型培养物保藏中心。RPMI-1640培养基、DMEM-F12培养基、PBS溶液及胰蛋白酶-EDTA（杭州吉诺生物），胎牛血清（Gibco公司），CCK-8试剂盒（日本同仁生物科技有限公司），FITCAnnexinⅤ-PI凋亡双染试剂盒（Roche公司），Hoechst33258（Sigma-Aldrich公司），兔抗人p-Histone H2A.x、PI3Kp110 、mTOR、GAPDH一抗（Cell Signaling Technology）。

1.2 细胞培养及分组

骨肉瘤细胞MG-63及U2-OS用RPMI1640培养基（10%胎牛血清）常规培养，置入37℃、5%CO2饱和湿度条件下的恒温培养箱中培养；人成骨细胞hFOB1.19在DMEM-F12培养基（10%胎牛血清），置入33.5℃、5%CO2饱和湿度条件下的恒温培养箱中培养。左旋含羞草碱溶于PBS溶液中，实验时直接加入培养基中达到实验终浓度，细胞分6组：空白对照组，100 M左旋含羞草碱组，200 M左旋含羞草碱组，400 M 含左旋羞草碱组，100 mg/mL柠檬酸铁胺组，400 M左旋含羞草碱+100mg/mL柠檬酸铁胺组。

1.3 CCK-8法检测细胞增殖

取处于对数生长期的人骨肉瘤细胞进行培养，待细胞生长至近融合状态，用0.25%胰蛋白酶消化细胞,吸管反复将细胞轻轻吹打呈单细胞悬液，用计数板计数，将细胞按1500个/孔接种于96孔板，置于37℃、含5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h使细胞完全贴壁生长，按照1.2步骤中的分组加药处理，每种浓度均设3个复孔。再分别培养24 h、48 h及72 h后取出培养板，每孔加入CCK8试剂10 L孵育1 h，用酶标仪检测490 nm处培养细胞的OD值，并按以下公式计算细胞生长抑制率：抑制率 (%)=肿瘤细胞抑制率 (IR)=(对照孔OD值-实验孔OD值)/对照孔OD值×100%。实验共重复3次，并描绘细胞生长曲线。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

取处于对数生长期的人骨肉瘤细胞或人成骨细胞进行培养，待细胞生长至近融合状态，用 0.25%胰蛋白酶消化细胞，将细胞轻轻吹打呈单细胞悬液，用计数板计数，将细胞按105个/孔接种于6孔板，置于培养箱中培养24 h，按照1.2步骤中的分组处理,每种浓度均设3个复孔。培养48 h后，收集细胞，离心，PBS洗涤一次，加入 FITC-Annexin V及PI染料，避光孵育30 min，上机检测。

1.5 Hochest染色法检测细胞核固缩

取处于对数生长期的人骨肉瘤细胞进行培养，待细胞生长至近融合状态，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，将细胞轻轻吹打呈单细胞悬液，用计数板计数，将细胞按104个/孔接种于6孔板，置于37℃、含5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h，按照1.2步骤中的分组处理，每种浓度均设3个复孔。培养48 h后，在培养基中加入Hoechst33258至终浓度为10 mg/L，避光孵育30 min，荧光显微镜下观察细胞核固缩比例并拍照。

1.6 蛋白印迹法检测DNA损伤信号通路关键蛋白表达

取对数生长期的人骨肉瘤细胞进行培养，按3×105个/瓶接种于培养瓶中，置于37℃、含5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h，按照1.2步骤中的分组处理，每组三瓶，培养48 h后，收集细胞，离心，PBS洗涤一次，加入细胞裂解液提取细胞总蛋白，测定浓度并调整各组一致。聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜及封闭后，分别加入兔抗人p-Histone H2A.x、PI3K p110、mTOR和GAPDH一抗4℃孵育过夜，洗涤后荧光二抗孵育1 h，LI-COR公司odyssey检测并分析结果。

2 实验结果

2.1 左旋含羞草碱可以显著抑制骨肉瘤细胞增殖

CCK-8检测结果（见图1-2，彩图见插页）显示，相比于对照组，左旋含羞草碱组的OD值随着作用时间及浓度的增加而明显下降，并呈剂量依赖性，且当作用时间为72 h，左旋含羞草碱浓度为400 M时，MG-63及U2-OS细胞的增殖抑制率分别达到81.1%±1.6%和76.7%±2.1%，而在此浓度条件下，加入100mg/mL的FAC后左旋含羞草碱对骨肉瘤细胞的抑制率明显下降，分别为 13.8%±2.3%和7.5%±1.1%，与400 M左旋含羞草碱组相比，具有明显的统计学差异（P＜0.001）。

图1，左旋含羞草碱处理后MG-63细胞增殖曲线。

图2，左旋含羞草碱处理后U2-OS细胞增殖曲线。

2.2 左旋含羞草碱可以有效诱导骨肉瘤细胞凋亡

流式细胞术检测结果（见图3，彩图见插页）发现，各组细胞培养48 h后，相比于对照组，左旋含羞草碱组的细胞凋亡率显著增高，并随着左旋含羞草碱浓度的增加而明显上升，并呈剂量依赖性，且当左旋含羞草碱浓度达到 400 M 时，MG-63及 U2-OS细胞的凋亡率分别为 54.1%±12.6%和46.2%±14.7%，而在此浓度条件下，加入100 mg/mL的 FAC后，MG-63及 U2-OS细胞的凋亡率显著降低，分别为10.1%±2.4%和7.5%±1.9%，与400 M 左旋含羞草碱组相比，具有明显的统计学差异（P＜0.001）。不仅如此，在各个浓度条件下的左旋含羞草碱均未对hFOB-1.19造成显著的细胞凋亡。

图3，左旋含羞草碱处理后MG-63，U2-OS及hFOB-1.19细胞凋亡率。

2.3 左旋含羞草碱可以显著诱导骨肉瘤细胞细胞核固缩

Hoechst染色结果（见图4，彩图见插页）显示，相比于对照组，400 M左旋含羞草碱组细胞核固缩比例显著增高，MG-63及U2-OS细胞的细胞核固缩比例分别为53.8%±10.6%、49.2%+8.3%，而在此浓度条件下，加入100 mg/mL的 FAC后，MG-63及U2-OS细胞的细胞核固缩比例明显减少，分别为11.5%±2.0%和13.6%±1.3%，与400 M左旋含羞草碱组相比，均具有明显的统计学差异（P＜0.001）。

图4，左旋含羞草碱处理后MG-63及U2-OS细胞Hoechst染色结果。

2.4 左旋含羞草碱调控骨肉瘤细胞DNA损伤修复相关信号通路关键蛋白表达

蛋白印迹检测发现，各个培养条件下，相比于对照组，左旋含羞草碱组 MG-63细胞的 DNA损伤修复相关蛋白表达水平显著改变，细胞DNA损伤标记物p-Histone H2A.x表达水平显著增高，PI3K p110及mTOR蛋白表达水平显著降低，而加入FAC后，与左旋含羞草碱组相比，p-Histone H2A.x表达水平显著降低，而PI3K p110及mTOR蛋白表达水平显著增高。

图5，左旋含羞草碱处理后MG-63细胞蛋白印迹检测结果。

3 讨论

左旋含羞草碱是从含羞草或银合欢中提取的生物活性物质，它的生物学活性作用近些年受到较多的研究，具有显著的抗肿瘤作用，包括前列腺癌、肝癌等[11,12]，其在骨肉瘤中的作用目前尚无研究报道，本研究发现左旋含羞草碱可以有效抑制骨肉瘤MG-63及U2-OS细胞系的细胞增殖，显著诱导细胞凋亡及细胞核固缩，并明显调节与骨肉瘤MG-63细胞DNA损伤修复相关的蛋白表达。

调节DNA损伤修复过程是药物治疗肿瘤的分子机制之一，p-Histone H2A.x是细胞出现DNA损伤的标记物之一[13]，本研究发现左旋含羞草碱处理后，骨肉瘤MG-63细胞中p-Histone H2A.X蛋白表达显著增高，进而表明左旋含羞草碱可诱导骨肉瘤细胞出现显著的DNA损伤，达到杀伤肿瘤细胞的作用。PI3K-mTOR信号通路在 DNA损伤及修复过程中发挥了重要的作用，Davis等的研究表明细胞出现 DNA损伤后，PI3K-mTOR信号通路关键蛋白会发生显著改变，有利于DNA损伤修复[14]，本研究也发现左旋含羞草碱处理后，骨肉瘤细胞PI3K-mTOR信号通路的关键蛋白mTOR及PI3KP110的表达也发生了显著下调，但是仍不能代偿其对DNA损伤的效应，进而发生显著的细胞凋亡。

有研究表明，左旋含羞草碱是一种铁螯合剂，可以螯合细胞内的二价铁离子，铁离子是细胞维持正常生物学功能的重要元素之一[15,16]。左旋含羞草碱诱导肿瘤细胞凋亡的生物学作用是否与这种生物学功能有关需要进一步的研究来证实，本研究的研究结果发现，在给予左旋含羞草碱处理同时，在细胞培养基中补充富含三价铁离子的柠檬酸铁胺，可以显著减弱左旋含羞草碱抑制骨肉瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用，骨肉瘤细胞的DNA损伤标记物p-Histone H2A.X水平显著降低，PI3K-mTOR信号通路关键蛋白表达水平趋于正常，表明左旋含羞草碱诱导骨肉瘤MG-63及U2-OS细胞发生细胞凋亡与左旋含羞草碱的铁螯合作用密切相关，这种效应的机制可能是左旋含羞草碱螯合了骨肉瘤细胞内的二价铁离子，导致骨肉瘤细胞的正常代谢活动受阻，从而引起DNA损伤而诱导骨肉瘤细胞凋亡等下一步的生物学过程。

综上所述，本研究结果表明，左旋含羞草碱可以有效抑制骨肉瘤细胞增殖并促进骨肉瘤细胞凋亡，其生物机制可能与促进细胞核固缩和调节细胞内DNA损伤修复相关蛋白的表达有密切关系。因此，对左旋含羞草碱在生物体内的抗肿瘤作用、毒副作用及生物安全性需要做进一步的深入研究，从而为其今后临床治疗骨肉瘤提供更多的实验依据，争取为临床治疗骨肉瘤开辟一条新的道路。

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