愈伤组织和培养温度对花生茎线虫繁殖力的影响

章淑玲, 林谷园, 肖　顺

(1.福建农业职业技术学院园艺园林系，福建 福州 350119；2.福建出入境检验检疫局 福建 福州 350001；3.福建农林大学植物保护学院，福建 福州 350002)

花生茎线虫(Ditylenchusarachis)是2014年我国首次报道危害山东和河北两省花生的一种病原线虫[1].该线虫主要侵染花生的根系、胚栓、果荚和种粒，致使受害花生植株根系减少、腐烂,结荚少,固氮根瘤菌减少，果荚外壳变黑、腐烂，种皮褐变、皱缩，严重降低了花生的产量和质量；该线虫还可寄生于花生田间的杂草以及在病果荚内长期存活，成为次年病害的初侵染源[1-2].因此，花生茎线虫已成为继根结线虫(Meloidogynespp.)后又一个可对我国花生产业造成严重影响的病原线虫[3].

为了防治花生茎线虫病，必须开展该病原线虫的生物学、病理学及遗传特性等方面的研究，而线虫培养条件的确定是对其全面系统研究的基础.目前,常用于线虫培养的方法有寄主接种法、离体组织培养法和真菌培养法等，其中,离体组织培养中的愈伤组织已广泛用于相似穿孔线虫(Radopholussimilis)、短体线虫(Pratylenchusspp.)、菊花滑刃线虫(Aphelenchoidesritzemabosi)、腐烂茎线虫(D.destructor)等的人工培养[4-8].本研究测试不同愈伤组织和培养温度下花生茎线虫的繁殖情况，以期为研究该线虫在我国的适生性、科学评估其危害以及制定有效的防控措施提供参考.

1　材料与方法

1.1　供试线虫

供试的6个花生茎线虫种群(表1)分别采自各地的花生茎线虫病果荚，用改良贝尔曼漏斗法[9]分离病果荚中的线虫.将分离的线虫悬浮液收集至1.5 mL离心管中，3 000 r·min-1离心2 min，去上清液；加入0.1%硫酸链霉素溶液，表面消毒10 min，再用无菌水清洗2～3次，备用.

表1　供试的花生茎线虫种群Table 1　List of tested D.ararchis populations

1.2　愈伤组织的制备

参考Reise et al[10]的方法，从市场上选取新鲜、健康、粗细一致的胡萝卜和甘薯块茎，洗净后切去块茎两端较细的部分，在超净工作台内，用75%乙醇对块茎的表面进行消毒.用灭菌刀削去块茎的表皮，再切成厚度约为10 mm(直径约为40 mm)的圆块，在酒精灯外焰上消毒2～3 s，迅速放入灭菌的培养皿中，用封口膜封闭后置于28 ℃恒温培养箱中黑暗培养14 d左右，待长出愈伤组织后备用.

1.3　不同愈伤组织下花生茎线虫的繁殖力测定

挑取消毒后的花生茎线虫Dar01种群的30条雌虫，分别接种到培养皿内长满愈伤组织的胡萝卜和甘薯圆块上，将培养皿重新封口后，置于28 ℃恒温箱中黑暗培养60 d，分别对愈伤组织里的线虫进行分离并计数.各处理设10个重复.

1.4　温度对愈伤组织上花生茎线虫繁殖力的影响

挑取消毒后的花生茎线虫Dar01种群的30条雌虫，接种于胡萝卜愈伤组织上，分别置于15、20、25、30和35 ℃恒温培养箱中黑暗培养60 d，分别对愈伤组织里的线虫进行分离并计数.各温度处理设10个重复.

1.5　不同地理种群花生茎线虫的繁殖力测定

挑取消毒后的6个不同地理种群(表1)各30条雌虫，分别接种到胡萝卜愈伤组织中，各地理种群分别设10个重复.培养60 d后，分别对愈伤组织里的线虫进行分离并计数.

1.6　线虫的分离、计数与统计分析

将培养皿中的愈伤组织取出，放入搅拌器(康华HJ-1型)中，加入适量的水进行搅拌，将搅拌后的悬浮液分别过100目、300目、500目组合的线虫过滤筛，用洗瓶反复冲洗300目和500目筛上的线虫至烧杯中.待线虫沉降后，将线虫悬浮液收集至10 mL离心管中，3 000 r·min-1离心2 min，弃多余液体，定容至1 mL.用移液管吸取20 μL线虫悬浮液于载玻片上，在体视显微镜下分别统计卵、幼虫、雌虫、雄虫的数量，重复3次，取平均值.根据定容的体积计算各处理重复的总虫数.

线虫的繁殖倍数=最终线虫繁殖量/初始线虫接种量.

采用SPSS PASW Statistics v18.0软件对获得的数据进行方差分析，并用Duncan′s新复极差法在P<0.05显著水平上进行多重比较，计算标准误.

2　结果与分析

2.1　愈伤组织对花生茎线虫繁殖力的影响

从图1及表2可见，花生茎线虫在供试的2种愈伤组织上均可繁殖；但在胡萝卜愈伤组织上的繁殖倍数为208.27，明显高于在甘薯愈伤组织上的繁殖倍数(6.93)，二者的差异达到显著水平(F=601.97;df=1,18;P<0.05.表3).

2.2　温度对花生茎线虫繁殖力的影响

由表4可见，温度对花生茎线虫在胡萝卜愈伤组织上的繁殖力存在显著影响.温度在15和35 ℃时花生茎线虫繁殖力低，有时甚至无法完成生活史.20～30 ℃时线虫在胡萝卜愈伤组织上能大量繁殖并完成生活史，且随着温度的升高，线虫的幼虫量、雌虫量、雄虫量、总虫数及繁殖倍数均逐渐增大，30 ℃时总虫数达7 728条，其中卵672条、幼虫5 064条、雌虫828条、雄虫1 164条，繁殖倍数为257.59，繁殖力与其他温度存在显著差异(P<0.05).

A:接种线虫60 d后的胡萝卜愈伤组织；B:接种线虫60 d后的甘薯愈伤组织；C:愈伤组织培养的花生茎线虫.图1　胡萝卜愈伤组织和甘薯愈伤组织对花生茎线虫的培养Fig.1　Cultivation of D.arachis on carrot callus and sweet potato callus

愈伤组织卵量/个幼虫量/条雌虫量/条雄虫量/条总虫数/条繁殖倍数胡萝卜100847002283126248208.27甘薯 1014634182086.93

表3　花生茎线虫在胡萝卜愈伤组织和甘薯愈伤组织上繁殖倍数的方差分析1)Table 3　Variance analysis of breeding multiple of D.arachis (Dar01) on carrot callus and sweet potato callus

1)*表示差异达到显著水平(P<0.05).

表4　不同培养温度下花生茎线虫在胡萝卜愈伤组织上的繁殖力1)Table 4　Reproductive ability of D.arachis (Dar01) on carrot callus at different temperatures

1)表中数值为10个重复的均值±标准误；同列数据后小写字母不同者表示在0.05水平上差异显著，字母相同者表示差异不显著.

2.3　花生茎线虫不同种群的繁殖力

将不同地理来源的花生茎线虫6个种群各30条分别接种于胡萝卜愈伤组织上，于28 ℃下黑暗培养60 d，各个种群均能繁殖并完成生活史.其中，Dar06的繁殖能力最强，60 d后的线虫总量达到7 232条，繁殖倍数为241.07；但不同种群的繁殖力不存在显著差异(P>0.05，表5).

表5　不同地理种群花生茎线虫在胡萝卜愈伤组织上的繁殖力1)Table 5　Reproductive ability of different populations of D.arachis on carrot callus

1)表中数值为10个重复的均值±标准误;同列数据后小写字母不同者表示在0.05水平上差异显著，字母相同者表示差异不显著.

3　结论

本研究结果表明，花生茎线虫在胡萝卜愈伤组织上的繁殖效果大大高于甘薯愈伤组织，培养60 d后虫量可达到6 000条以上，且胡萝卜愈伤组织的制备和操作简单、不易污染、培育周期短，适用于花生茎线虫的快速大量繁殖.甘薯愈伤组织因含水量低，在培养后期不易腐烂，适用于线虫的长期保存.花生茎线虫繁殖的适宜温度为20～30 ℃，30 ℃时繁殖量最高，温度低于15 ℃或高于35 ℃不适于该线虫繁殖.花生茎线虫不同地理种群在胡萝卜愈伤组织上的繁殖力差异不显著，这一结果说明我国花生茎线虫种群间比较保守，不存在明显的地理变异[11].

[1] ZHANG S L, LIU G K, JANSSEN T, et al. A new stem nematode associated with peanut pod rot in China: morphological and molecular characterization ofDitylenchusarachisn. sp. (Nematoda: Anguinidae)[J]. Plant Pathology, 2014,63(5):1 193-1 206.

[2] 章淑玲.花生茎线虫(Ditylenchusarachisn. sp.)新种鉴定、生物学及快速检测技术[D].福州:福建农林大学,2016.

[3] 中国农业百科全书编辑部.中国农业百科全书·植物病理学卷[M].北京:农业出版社,1996:212.

[4] 廖琳琳,肖顺,刘国坤,等.温度对短尾根腐线虫繁殖力的影响及其胚胎发育过程[J].福建农林大学学报(自然科学版),2017,46(3):247-249.

[5] 武玉环,徐春玲,张超,等.不同培养方法对相似穿孔线虫致病力的影响[J].华中农业大学学报,2015,34(6):49-54.

[6] 彭晓放,陈德强,王东伟,等.菊花滑刃线虫的培养条件和繁殖特性[J].华中农业大学学报,2015,34(5):48-51.

[7] 阎爱华,曹克强,陈书龙.培养时间和接种密度对咖啡短体线虫繁殖和形态的影响[J].华北农学报,2006,21(S1):135-139.

[8] 徐春玲.中国腐烂茎线虫的形态鉴定和遗传多样性研究[D].广州:华南农业大学,2007.

[9] 张绍升.植物线虫病害诊断与治理[M].福州:福建科学技术出版社,1999:71-89.

[10] REISE R W, HUETTEL R N, SAYRE R M. Carrot callus tissue for culture of endoparasitic nematodes[J]. Journal of Nematology, 1987,19(3):387-389.

[11] 王文玉.花生茎线虫(Ditylenchusarachis)的生物学特性及种群遗传多样性[D].福州:福建农林大学,2017.