水浴消解与传统工艺制备北部湾南美白对虾甲壳素研究

蓝尉冰,王帅静，韩鑫,肖金亮

(1.钦州学院，广西 钦州　535099；2.广西高校北部湾特色海产品资源开发与高值化利用重点实验室(钦州学院)，广西 钦州　535099；3.广西大学，南宁　530004；4.武汉理工大学，武汉　430063)

甲壳素又名甲壳质、壳蛋白和壳聚糖，甲壳素及其衍生物以独特的功能和特性被广泛应用于环境保护、食品、医药等领域[1]。如甲壳素直接被用来制造味精及酱油等调味品[2]，甲壳素经脱乙酰得壳聚糖作为调味品[3]，南美白对虾是世界养殖产量最高的三大优质虾种之一，而我国的南美白对虾除鲜售外大部分加工成去头、去壳的冻虾和虾仁出口，在此过程中产生大量的虾类废弃物，造成资源浪费及环境污染[4]，因此这些废弃物的利用应给予足够的重视。目前，国内外新兴的甲壳素制备方法主要有酶法[5]、发酵法[6]、化学改良法等[7-11]，但对南美白对虾甲壳素制备过程中数学表达式及模型建立研究较少。故本实验采用水浴消解技术来优化传统工艺，使脱除蛋白和脱除碳酸钙盐可在较短时间内完成，建立广西北部湾地区南美白对虾废弃物制备甲壳素数学表达式，从而有效利用广西北部湾水产资源，减少废弃物排放，有效降低环境污染。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

新鲜南美白对虾：购自广西钦州钦南区东风海鲜市场。

1.2　仪器与设备

EL204电子天平、EL20实验室pH计、HH-S4数显恒温水浴锅梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司； SZ-500A-3超高速多功能粉碎机永康市善竹贸易有限责任公司；V-1800PC可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司。

1.3　试验方法

1.3.1制备工艺

虾头、虾壳→烘干预处理→NaOH溶液脱蛋白(水浴条件下)→水洗至中性→烘干→盐酸脱钙(水浴条件下)→水洗至中性→烘干→过氧化氢溶液漂白→水洗至中性→低温干燥→甲壳素产品[12]。

1.3.2脱蛋白单因素试验

以脱蛋白率为指标，分别按以下考察因素进行试验：料液比1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35(g/mL)；反应时间0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h；反应温度60，70，80，90，100 ℃；NaOH浓度1%，3%，5%，7%，9%后离心测定上清液蛋白质含量。

1.3.3蛋白质含量测定

考马斯亮蓝法[13,14]。

1.3.4蛋白质脱除率测定

式(1)

式中：α为脱蛋白率，%；x为蛋白质含量，μg；V1为提取液总体积，mL；V0为测定时取用提取液体积，mL；m0为预处理样品的质量；X1为预处理样品中蛋白质的质量分数，%。

1.3.5脱钙工艺

基于本课题组前期工作，选择脱钙工艺为HCl浓度3%，水浴时间1.0 h，水浴温度60 ℃，料液比1∶35(g/mL)。

1.3.6脱钙率W测定[15,16]

用移液管移取1 mL上清液于100 mL的锥形瓶中，加入10 mL蒸馏水、1 mL浓度为10% NaOH溶液及钙指示剂2～3滴，充分混匀后，用EDTA溶液滴定，锥形瓶中溶液从红色变为蓝色，即为终点。平行标定3次，记下所消耗的EDTA溶液的体积。

脱钙率W按下式计算：

式(2)

式中：W为脱钙率，%；V为溶液体积，mL； VEDTA为滴定消耗的体积，L； CEDTA为EDTA浓度，mol/L；MCa为钙的摩尔质量，g/mol；m为脱蛋白后的质量，g；X2为脱蛋白后样品中钙的质量分数，%。

1.3.7甲壳素得率测定

将脱蛋白、脱钙后所得样品进行双氧水漂白(10%，80 ℃，2 h)，洗净烘干即可得到甲壳素，甲壳素得率为：

式(3)

1.4　水浴消解脱蛋白正交试验

采用4因素3水平的分析方法进行正交试验设计[17]，见表1。

表1　正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.5　传统工艺

取预处理过的虾头、虾壳粉，调整料液比，加入10%氢氧化钠，于100 ℃加热2.0 h，不停搅拌，冷却至室温，抽滤蒸馏水洗至中性，重复此步2次后用5% HCl溶液于室温下浸泡8.0 h，不断搅拌，水洗滤渣至中性，重复此步2次。之后用双氧水漂白，干燥，即得甲壳素产品。

1.6　数据处理

采用Origin 8.0 进行数据处理及图表处理。

2　结果与分析

2.1　水浴时间对脱蛋白率的影响

水浴时间对虾废弃物脱蛋白率的影响见图1。

图1　水浴时间对脱蛋白率的影响及拟合曲线Fig.1 Effect of water bath time on protein removal rate and fitting curve

水浴时间在0.5～1.5 h脱蛋白率呈上升趋势，水浴时间达1.5 h时脱蛋白率达最高；之后随水浴时间延长脱蛋白率呈下降趋势，可能是因为时间越长会导致产品的水解，因此水浴时间取1.5 h为最佳。且对该曲线进行拟合，符合Gauss 函数模型，所得拟合曲线方程见为式(4)，y0=50.53232,Xc=1.49095,W=1.34464,A=20.99076,拟合判定系数R2=0.98,说明此模型符合，在水浴时间为0.5～2.5 h时，虾头虾壳脱蛋白都有规律，可根据所得方程估算出用量，控制脱蛋白率。

式(4)

2.2　水浴温度对脱蛋白率的影响

水浴温度对脱蛋白率的影响见图2。

图2　水浴温度对脱蛋白率的影响Fig.2 Effect of water bath temperature on protein removal rate

由图2可知，温度越高，脱蛋白质的效果越好，当温度达80 ℃时脱蛋白率达最高，而当温度超过80 ℃时脱蛋白率有下降趋势，从经济角度考虑，以80 ℃的水浴温度脱蛋白质为最佳。

2.3　料液比对脱蛋白率的影响

料液比对脱蛋白率的影响见图3。

图3　料液比对脱蛋白率的影响Fig.3 Effect of material-liquid ratio on protein removal rate

料液比对脱蛋白率有显著影响，其趋势是先增大后降低。料液比为1∶15～1∶20(g/mL)时脱蛋白率呈上升趋势，当达到1∶20(g/mL)时脱蛋白率最高，后脱蛋白率呈下降的趋势，因此脱蛋白时料液比取1∶20(g/mL)为最佳。

2.4　NaOH浓度对脱蛋白率的影响

图4　NaOH浓度对脱蛋白率的影响及拟合曲线Fig.4 Effect of NaOH concentration on protein removal rate and fitting curve

由图4可知，脱钙率随NaOH的浓度增大呈先增大后下降的变化趋势，呈非线性状态，在1%～3%脱蛋白率呈上升趋势，当NaOH浓度在3%时达最高，当继续提高NaOH浓度时，脱蛋白率呈下降趋势。对该曲线进行拟合，符合Gauss 函数模型，所得拟合曲线方程见式(4)。y0=38.94297，Xc=3.7871，W=3.17071，A=111.26518，拟合判定系数R2=0.96,说明此模型符合，在NaOH的浓度为1%～9%时，虾头虾壳脱蛋白都有规律，可根据所得方程估算出用量，控制脱蛋白率。

2.5　水浴脱蛋白正交试验结果

表2　正交试验结果Table 2 Orthogonal test results

续　表

由表2可知，料液比的极差R为8.404，水浴时间的极差R为1.830，碱浓度的极差R为12.677，水浴温度的极差R为7.056。由此可知，碱浓度是影响脱蛋白率的最主要因素，综合考虑，影响脱蛋白率的因素的主次为：NaOH浓度>料液比>水浴温度>水浴时间。根据极差分析结果可知，脱蛋白的最佳工艺参数为：A3B1C2D1，即NaOH浓度为3%，料液比为1∶20(g/mL)水浴温度为80 ℃，水浴时间为1.5 h。

为进一步判断上述4因素对正交试验结果的影响是否显著，将正交试验数据进行方差分析，选择水浴时间为误差所在的列，结果见表3。

表3　方差分析Table 3 Variance analysis

注：**表示非常显著水平(F>F0.01(2，2))；*表示显著水平(F0.05(2，2)

由表3可知，在95%置信度时，误差所在列为水浴时间，料液比与碱浓度对脱蛋白率的影响显著，而水浴时间和水浴温度对脱蛋白率影响不显著，这说明料液比和NaOH浓度对脱蛋白率起主要作用，水浴温度和水浴时间对脱蛋白率影响不大。

2.6　最佳工艺条件的验证分析

本试验以南美白对虾虾头、虾壳为原料，通过脱蛋白、脱钙、脱色素三步骤提取甲壳素，以脱蛋白率、甲壳素得率为指标，分别通过对脱蛋白进行单因素试验和正交试验，经正交结果分析，脱蛋白的最佳工艺条件为NaOH浓度3%，料液比1∶20(g/mL)，水浴温度80 ℃，水浴时间1.5 h；为提高试验的可信度，在此条件下验证，5次验证试验得到的甲壳素的得率分别为23.88%，24.02%，23.92%，24.00%，23.87%。通过验证试验发现甲壳素的平均得率可达23.94%，故甲壳素提取工艺稳定可行。

2.7　水浴消解与传统工艺提取甲壳素的结果比较

表4　水浴消解与传统工艺提取甲壳素结果比较Table 4 Comparison of water bath digestion and traditional process for chitin extraction　%

由表4可知，用水浴消解法提取甲壳素时，脱蛋白率为75.12%，脱钙率为96.00%，甲壳素得率为23.94%；传统工艺提取甲壳素时，脱蛋白率为52.45%，脱钙率为70.54%，甲壳素得率为14.63%。由此可知，水浴消解提取甲壳素比传统工艺多了9.31%，该方法不仅可以解决传统工艺的一些不足，而且可以提高甲壳素得率。

3　结论

本次试验采用水浴消解法优化传统工艺，考察水浴时间、水浴温度、料液比、NaOH浓度制备甲壳素过程的规律研究，脱蛋白率都随水浴时间、水浴温度、料液比、碱浓度增大呈先增大后减小的趋势，且时间、NaOH浓度对脱蛋白率符合Gauss 函数模型，所得拟合曲线方程系数分别为y0=50.53232，Xc=1.49095，W=1.34464，A=20.99076，R2=0.98及y0=38.94297，Xc=3.7871，W=3.17071，A=111.26518，R2=0.96。4个因素对脱蛋白率的影响依次为：NaOH浓度>料液比>水浴温度>水浴时间。最佳工艺参数为：A3B1C2D1，即NaOH浓度3%，料液比1∶20(g/mL)，水浴温度80 ℃，水浴时间1.5 h。水浴消解提取甲壳素比传统工艺多了9.31%,这能为有效提取甲壳素提供一定的理论支撑，同时也能缓解提取甲壳素时所造成的污染问题的严重性。

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