克拉玛依果树腐烂病病原菌鉴定及其拮抗菌的筛选

牛春林，叶晓芸，艾 尼，王振华，热依汗，姜国勇，高 雁，宋素琴，楚 敏

(1.新疆石油管理局造林减排作业区，新疆克拉玛依　834000；2.新疆农业科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐　830091)

0　引 言

【研究意义】近10余年来，在国家实施西部大开发战略和新疆产业结构调整下，新疆特色林果种植飞速发展，林果业已成为新疆农业增效、农民增收的重要手段[1,2]。但随着种植面积的增加，加之田间日常管理和水肥管理的不足，以及近年来气候因素等，果树腐烂病发病严重，已造成果树枯死，果园减产，严重的造成毁园，制约了新疆特色林果业的发展[3]。因此，研究果树的腐烂病病原及筛选相关生防菌剂对高效生物防治该病具有重要的意义。【前人研究进展】 果树腐烂病又名烂皮病，主要危害枝干, 致使皮层腐烂坏死，常表现为溃疡型和枝枯型两种类型。果树腐烂病因其分布广、难治愈、高复发等特点，是果树生产中重要的病害之一[4,5]。目前，新疆主要特色林果如苹果、香梨、桃树、核桃等果树均有不同程度的发病[6-10]。研究表明，果树腐烂病主要由壳囊孢菌Cytospora属(有性型为苹果黑腐皮壳菌Valsa属)引起，我国目前已知相关病原菌共涉及该属下6个种[11]。【本研究切入点】在现有报道中，新疆苹果树腐烂病致病菌有C.chrysosperma、C.mali、C.schulzeri和C.leucostoma引起，但存在着区域分布不迥，而有关李子树腐烂病，此前国内尚无报道。研究通过形态学、生理生化特性及分子生物学方法确定苹果树与李子树病原菌的分类地位；采用组织分离法和平板对峙法筛选得到拮抗效果较好的拮抗菌。【拟解决的关键问题】以新疆克拉玛依绿城实业有限公司生态果园内苹果树和李子树腐烂病为研究对象，对其致病菌进行分离鉴定，并开展其相关拮抗菌的筛选，为新疆果树腐烂病病原多样性和开展相关生物防治提供科学依据和奠定基础。

1　材料与方法

1.1　材 料

1.1.1腐烂病样本

苹果树和李子树腐烂病样本采集自新疆克拉玛依绿城实业有限公司生态果园内。

1.1.2土样采集

用于拮抗菌分离的土样采集于生态果园内果树根部地下5～20 cm土壤。

1.1.3筛选培养基

完全培养基：蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，磷酸氢二钾 3.0 g，葡萄糖1.0 g，琼脂15 g/L，水1 000 mL，pH 7.0～7.2。

其它常见培养基：马铃薯-葡萄糖琼脂培养基(PDA)，高氏一号培养基(Gause' s No.1)。

1.2　方 法

1.2.1病原菌分离

取苹果树和李子树腐烂病样本枝条，在无菌工作台中，先用75%的酒精消毒30 s，其次1.2% NaClO消毒3 min，然后用无菌蒸馏水清洗3次进行表面消毒，放在无菌滤纸上晾干。 切取5 mm×5 mm左右具有典型腐烂病病征的组织块，移至准备好的PDA(含氯霉素)培养基上，置于28℃恒温培养，并观察菌落长出后挑取边缘菌丝，进行菌种纯化和保藏[12]。

1.2.2拮抗菌分离

拮抗菌的分离采用双层平板法进行分离筛选。为了筛选快速生长并产生拮抗作用的菌株，采用黑曲霉作为指示菌，孢子悬液控制在104～105CFU/mL，取0.2 mL均匀涂布于下层PDA培养基上，待悬液被培养基吸收后，倒入45℃左右的完全培养基或高氏培养基，待其凝固后备用[13,14]。

无菌条件下称取土样5 g， 置于装有50 mL 0.85 %生理盐水三角瓶中(装有无菌玻璃珠)，30℃ 条件下 120 r/min 振荡 0.5 h，静置。壤悬液经梯度稀释后，吸取0.2 mL涂布至上述平板上，于 30℃ 恒温培养，并观察菌落生长和抑菌情况，挑选具有明显抑菌圈，菌株菌落形态、大小及颜色不同菌落，进行分离纯化后，斜面4℃保存备用。

1.2.3拮抗菌复筛

拮抗菌株的复筛采用平板对峙法进行。以分离到的苹果树和李子树腐烂病病原为指示菌。首先，将病原菌接种于PDA 平板进行活化，30℃下培养至病原菌长满平板，用灭过菌的0.5 cm打孔器对病原菌打孔制成菌饼。然后，接种菌饼于PDA平板中心，采用四点对峙法将拮抗，每处理重复3次，并以未接拮抗菌的病原菌为对照，28℃恒温培养箱培养4 d后，观察并测定抑菌效果[10,15]。

1.2.4菌株的分子生物学鉴定

病原真菌ITS 序列采用通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’， ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’进行ITS序列PCR扩增。细菌16S rDNA序列采用通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'进行16S rDNA 的PCR扩增。

PCR产物经切胶纯化回收后，送往北京鼎国生物技术有限公司进行测序，所测得序列人工校正后，真菌序列在http://www.westerdijkinstitute.nl/Collections/DefaultInfo.aspx数据库上进行比对，细菌序列在EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify)数据库上进行比对，并分别调取同源性最高模式菌株及相关菌株序列, 使用MEGA5.0进行CLUSTAL X多重比对，使用NJ法构建系统发育树[16]，自举值(Bootstrap) 为1 000。

2　结果与分析

2.1　腐烂病病原菌的分离与鉴定

2.1.1腐烂病原菌分离与纯化

经分离纯化，分别从苹果树和李子树腐烂病病害典型样本中，分离得到真菌菌株5株，通过平板生长情况及菌落形态学特征分析，初步确定菌株可分为两类，其中编号PF1、PF2、LF1为第一类，菌丝生长迅速，菌落初期为白色，羽毛状扩展，中间部位气生菌丝明显，棉絮状，之后逐渐变为灰白色。约4 d长满平板。后期菌丝体逐渐变为灰白至黑褐色，并分泌灰黑色(图1)；编号LF2、LF3为另一类，菌丝生长迅速，菌落初期为白色，羽毛状扩展，中间部位气生菌丝明显，棉絮状，之后逐渐变为灰白色。约4 d长满平板。后期菌丝体逐渐变为灰白至黑褐色，并分泌灰黑色(图2)。同时，研究发现，苹果树腐烂病仅涉及第一类，而李子树腐烂病两类均有发现。图1，图2

2.1.2病原菌分子鉴定

所得菌株分别利用真菌ITS 序列通用引物进行PCR扩增，获得长度约为600 bp 的PCR产物，通过进一步序列测定和校正后，分别在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)及http://www.westerdijkinstitute.nl/ Collections/DefaultInfo.aspx数据库上进行比对。通过在线比对，发现所得菌株均与Valsa属。进一步系统进化树构建表明，菌株PF1、PF2、LF1与ValsamaliTY121同源性为100%；菌株LF2和LF3与ValsaleucostomaBJFU SXLM1064同源性为100%，初步确定研究所得腐烂病病原菌为Valsamali和Valsaleucostoma，其中苹果树腐烂病病原菌仅为Valsamali，而李子树腐烂病病原菌两者均有。图3

图1PF1,PF2,LF1菌落形态
Fig.1Colony morphology of PF1,PF2 and LF1

图2LF2,LF3菌落形态
Fig.2Colony morphology of LF2 and LF3

图3基于真菌ITS序列建立的病原菌NJ系统进化树
Fig.3NJphylogenetictreeofpathogenicfungibasedon16SrDNAsequence

2.2　拮抗菌的分离和鉴定

以黑曲霉为指示菌，采用双层平板法，对采集的生态果园内果林根部土壤开展了拮抗菌的分离筛选。通过样品稀释涂布，菌种的分离，共获的对黑曲霉具有拮抗作用的菌株15株，其中细菌10株，放线菌5株。

15株菌株16S rDNA序列经PCR扩增和测序，所得序列提交至 EzTaxon 数据库(http://www.ezbiocloud.net/identify)进行相似度比较，同时分别调取各菌株同源性最高模式菌株序列，构建系统进化发育树。所得菌株分别归属于链霉属、诺卡氏菌属、类芽孢菌属及芽孢菌属，总计4个属9个种，其中芽孢菌属涉及种类最多，共5个种；其次链霉属，涉及2个种。图4

图4基于16S rDNA序列建立的拮抗菌NJ系统进化树
Fig.4NJ phylogenetic tree of antagonistic bacterium based on 16S rDNA sequence

2.3　果树腐烂病原菌拮抗菌的复筛

果树腐烂病病原菌拮抗菌的复筛采用平板对峙法进行。以分离到的苹果树和李子树腐烂病病原菌PF1和LF2为指示菌。先将病原菌菌饼接种至PDA平板中心，采用四点对峙法进行拮抗菌的复筛，研究表明，所分离的拮抗菌对PF1和LF2抑制效果存在着区别，但总体差别不大。链霉菌A1和芽孢杆菌B4、B6对所得的腐烂病病原菌具有较好的抑制的效果，抑菌圈菌落比最大分别可以达到1.95、2.11和2.79。图5

进一步对菌株芽孢杆菌B4和B6对腐烂病抑制效果分析发现，尽管两株菌均具有较好的抑菌效果，但两者对病原菌的抑菌圈形状不同，病原菌受菌株B4抑制时，抑菌圈边缘较为整齐，真菌基丝和气生菌丝基本在一个垂面，且受抑制处边缘明显有大量真菌孢子产生。而病原菌受B6抑制时，抑菌圈边缘不整齐，真菌气生菌丝比基丝明显受抑制，菌丝体由内至边缘逐渐变薄，同时在两株菌的相互作用的过程中，在菌株B6菌落周围形成了一个明显的晕圈，相关不同的抑制机理还有待进一步研究。图6

图5拮抗菌对果树腐烂病病原菌抑菌活性
Fig.5Antagonistic activity of bacterium against to the pathogen of fruit tree canker

注：A:芽孢杆菌B4和 B6对Valsamali的拮抗平板; B:芽孢杆菌B6抑菌圈边缘特征;C:芽孢杆菌B4抑菌圈特征;D:Valsamali受芽孢杆菌B6拮抗抑菌圈边缘菌丝显微特征；E:Valsamali受芽孢杆菌B4拮抗抑菌圈边缘菌丝显微特征

Note:A: Antagonistic plates of Bacillus B4 and B6 againstValsaMali; B: Edge characteristics of the inhibition zone by B6;C: Edge characteristics of the inhibition zone by B6;D: Microscopic characteristics of the edge mycelia ofValsaMaliaround inhibition zone by B6;E: Microscopic characteristics of the edge mycelia ofValsaMaliaround inhibition zone by B4

图6芽孢杆菌B4和B6对Valsa mali抑制效果
Fig.6Inhibitory effect of B4 and B6 against Valsa mali

3　讨 论

腐烂病作为我国北方林果树木的常见病害之一，涉及林木种类多，发病区域广泛，最南至江苏徐淮地区均发现腐烂病的发生[17]。已在常见林果树木如苹果树、梨树、杨梅树、红枣树、核桃树、杨树、榆树、国槐树、胡杨树等树木均发现有腐烂病的发生[18]。相关研究表明，上述腐烂病的主要病原菌为由壳囊孢菌Cytospora属(有性型为腐皮壳菌Valsa属)引起，我国目前已知相关病原菌共涉及该属C.mali、C、malicola、C.chrysosperma、C.schuzeri、C.atrocirrhata和C、persoonii(C.leucostoma)等5个种，而相同种间亦存在致病力差异。

目前，新疆林果是我国腐烂病发病主要地区之一，主要栽培果树中均发现腐烂病。相关研究证明我区的果树腐烂病存在着多种病原菌，郭开发等[8]对新疆南疆核桃树腐烂病菌进行了分子学鉴定，确定其致病菌为金黄壳囊孢C.chrysosperma。唐俊煜等[9]对库尔勒香梨树腐烂病菌生物学特性与致病性的初步研究发现，其致病菌为金黄壳囊孢C.chrysosperma。刘应敏等[10]对新疆苹果树腐烂病病原菌的分离、鉴定及其生物学特性进行了研究，发现菌株C能够在新疆苹果树上造成危害。新疆林果业主要布局在南疆地区，目前对北疆地区果树腐烂病的研究较少。

研究针对新疆克拉玛依绿城实业有限公司生态果园内苹果树和李子树腐烂病的病原菌进行了筛选鉴定，确定苹果树腐烂病病原菌为Valsamali，李子树腐烂病病原菌分别包括Valsamali和Valsaleucostoma。该研究不仅进一步证明了新疆果树腐烂病病原菌存在着多样性，也在国内首次报道了李子树腐烂病病原菌，相关研究对新疆腐烂病研究具有明显的指导意义。同时，研究筛选获得了多株具有不同效果的拮抗菌，为我区果树腐烂病的生物防治替代了科学依据和材料。

4　结 论

新疆克拉玛依绿城实业有限公司生态果园内苹果树和李子树腐烂病的病原菌初步确定苹果树腐烂病病原菌为Valsamali，李子树腐烂病病原菌分别包括Valsamali和Valsaleucostoma。

所得各类拮抗真菌菌株15株，分别归属于链霉属、诺卡氏菌属、类芽孢菌属及芽孢菌属，总计4个属9个种，其中芽孢菌属涉及种类最多，共5个种；其次链霉属，涉及2个种。

筛选到高效拮抗细菌2株，芽孢杆菌B4和B6对腐烂病具有较好抑菌效果，其最大抑菌圈菌落比可分别达到2.11和2.79，但两者对病原菌的抑菌圈形状不同。

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