温度调控及不同营养强化剂对云纹石斑鱼亲鱼血清性激素水平的影响

邵彦翔 ，陈超 ，李炎璐 ，张廷廷 ，张梦 ，孙涛 ，曲江波

（1.农业部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室，中国水产科学研究院黄海水产研究所，山东 青岛 266071；2.烟台天源水产有限公司，山东 烟台 264003）

云纹石斑鱼（Epinephelus moara）俗称草斑、油斑，隶属硬骨鱼纲（Osteichthyes），鲈形目（Perciformes），鮨科（Serranidae），石斑鱼亚科（Epinephelinae），石斑鱼属（Epinephelus），是暖水性中下层礁栖鱼类中的一种，主要分布于北太平洋西部以及中国台湾沿海地区，是我国南方重要的海水养殖品种。它肉质鲜美、生长迅速、具有较高的经济价值。云纹石斑鱼野生资源有限，加之人为过度捕捞，自然资源逐渐减少。另外，云纹石斑鱼在石斑鱼属中是比较难以繁育的种类之一，直至2001年，日本三重县水产技术中心在云纹石斑鱼人工繁育技术方面取得突破[1]。我国对云纹石斑鱼的研究始于20世纪70年代后期，研究内容主要涉及云纹石斑鱼的生物学特性及形态发育[2-4]、摄食和生长特性[5]、淋巴囊肿病[6]、染色体核型[7]、营养需求与规模化养殖[8-10]等方面。

目前国内对云纹石斑鱼亲鱼营养强化以及温度调控方面的研究很少。区又君[11]指出，我国海水鱼类实现人工育苗大规模生产的前提是要积蓄足够数量的亲鱼和获得大量优质的受精卵。对亲鱼进行科学有效的营养强化培育，促使其性腺充分成熟和自然排卵，是获得优质受精卵最为经济、有效的方式[12]。鱼类能够按照周围环境的周期性综合调整其生理功能，事实上，诸多生理活动过程的内在周期性依赖于环境的周期性变化，根据环境的变化产生应答反应，光照和温度对调节鱼类的生殖周期最为重要[13-14]。本研究从温度调控和营养强化两个方面，开展了云纹石斑鱼亲鱼培育的相关研究工作，以期为云纹石斑鱼的人工繁育及健康养殖提供理论依据与参考。

1材料与方法

1.1 实验鱼的饲养

2015年3月—6月在烟台天源水产有限公司开展温度调控与营养强化实验。选取270尾5龄以上、身体健壮、肥满度好的健康云纹石斑鱼亲鱼，平均体质量（5.20±0.15）kg，体长（75.11±0.60）㎝，将实验鱼随机分配到9个30m3的水泥池中养殖。初始养殖水温（15±0.2）℃，投喂冰冻新鲜杂鱼，每日饱食投喂2次（09:00、16:00）。实验用水符合（GB11607-89）国家渔业水质标准。盐度（28.2±0.5），pH（7.4±0.5）。每日早、晚各换水60%，在保证水质的前提下，确保换水前后温差不大于0.5℃。

1.2 实验设计

3月2号开始逐渐升高水体温度进行温度调控，由初始养殖水温15℃逐渐升温至17℃后保持水温稳定，4月初继续升温至19℃并保持一个月。5月份水温保持在21℃，6月初水温上升到23℃并一直保持稳定到产卵结束。升温期间保证足够的光照强度及光照时间。每个养殖池上方配备两个100W的灯泡，每天5：00开灯持续到19：00。将9个养殖水池随机分成3组，实验组分别投喂美国产虾青素与日本产营养强化剂，投喂剂量每10 kg鲜杂鱼添加15 g营养强化剂，空白组不添加。每月初用MS-222麻醉3组亲鱼并吸干鱼体表面水分,用10 mL一次性无菌注射器从亲鱼尾部静脉取血，血样存放于10 mL离心管中并在4℃冰箱静置5～6 h后离心，取上清液置于-80℃超低温冰箱备用。

1.3 指标检测

采用酶联免疫分析（ELISA）的方法测试亲鱼血清中睾酮（T）和雌二醇（E2）的含量。酶联反应分析的试剂盒购自齐一生物科技（上海）有限公司。E2的测定原理采用的双抗体夹心法，用纯化的E2抗体包被微孔板，制成固相抗体，往充满单抗的微孔板中依次添加纯化的E2，使之与被HRP标记的E2抗体相结合，经过相关反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，对反应物进行彻底清洗后加入TMB显色。TMB在HRP酶的催化作用下反应生成蓝色物质，与酸反应最终变为黄色，反应产物颜色的深浅和血清中E2浓度呈正相关关系。在450 nm波长下用酶标仪测定其OD值，根据标准品画出标准曲线，通过曲线计算样品中鱼E2含量。T含量的测定原理与E2相同。

图1温度调控对石斑鱼亲鱼性激素的影响

1.4 数据统计与处理

采用Excel和SPSS 16.0软件对实验数据进行处理分析，显著性差异以（P＜0.05）为标准，结果以平均值±标准误（Mean±SE）的方式呈现。以Excel 2007统计软件中的非线性回归（Nonlinear regression）分析吸光度与激素含量的关系，选定R2最大值的函数关系式作为最佳曲线。E2标准曲线满足方程y＝3.644 x3-12.464 x2+23.27x-4.9065，R2＝0.9981。T 标准曲线满足方程y＝37.991 x3-134.98 x2+204.23x-55.875，R2＝0.99652。

2 结果

2.1 温度调控对亲鱼性类固醇类激素的影响

如图1所示，在温度调控下云纹石斑鱼亲鱼从3月初到5月初，血清中E2的含量上升后略微降低，6月初E2达到最大值但到9月份又表现出下降的趋势。云纹石斑鱼亲鱼血清中T含量在4月初略微上升，5月初血清T含量有所降低，6月初与E2变化类似，T含量达到最高峰，但在9月份呈现下降趋势。

2.2 亲鱼性类固醇激素对营养强化响应

图2不同强化剂对石斑鱼亲鱼性激素的影响

选取云纹石斑鱼亲鱼体内激素变化明显的4、5、6月份与空白组作对照，如图2所示：4月初营养强化实验组亲鱼血清中E2含量均高于空白对照组，并且添加日产营养强化剂的实验组激素含量略高于添加虾青素的实验组。5月初添加虾青素营养强化的实验组含量高于添加日产强化剂的实验组，并且两个营养强化实验组亲鱼血清中激素含量均高于空白对照组。6月份，两种营养添加剂实验组E2含量基本持平，均略高于空白对照组。

添加两种营养强化剂强化后，云纹石斑鱼血清中睾T含量呈现出较明显变化。4月初，添加日产强化剂的实验组效果略高于添加虾青素组，且两试验组激素含量均高于空白对照组。5月初，两试验组血清中T含量基本持平，且均高于空白对照组。6月初两实验组血清中T含量均明显高于空白对照组，添加虾青素营养强化的实验组与空白对照组相比呈现统计学意义差异（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 温度调控对亲鱼性类固醇激素的影响

亲鱼血清性类固醇激素的含量由其在性腺等组织中的产生速度以及在血液和组织中的代谢速度等因素决定[15]，在亲鱼的生殖过程有着极其重要的作用。性类固醇激素在调节脊椎动物下丘脑-垂体-性腺轴的发育成熟及维持功能等方面都起着重要作用[16]。鱼类的性类固醇激素主要有雌二醇（E2）、睾酮（T）、11-酮睾酮（11-KT）、17α，20β-双羟孕酮（DHP）等几种。内源性类固醇激素主要有有雌激素、雄激素和孕激素三种，它们所涉及的许多生理功能通过核受体的介导来完成。在亲鱼性腺的整个发育过程中，内源性类固醇激素中的一种或者两种在发育过程中占据优势，它们之间可以相互转化[17]。

亲鱼血清中E2水平随着卵黄形成而出现相应变化，原因是E2能够诱导肝细胞合成卵黄蛋白原[18-19]。本实验中，云纹石斑鱼的血清E2含量从4月份时开始逐渐升高，5月份出现略微下降，在6月繁殖季节达到最大值，并维持一段时间之后开始逐渐降低，血清E2的变化趋势基本符合石斑鱼卵巢发育的周年变化规律。与其他水生生物相似，在繁殖季节亲鱼血清T含量明显高于非繁殖季节，但与其他水生生物如水生哺乳类、硬骨鱼类等物种相比较，不同品种之间的血清T浓度还是存在较大差异[20,21]。本实验中，3-5月份血清中T含量变化不显著，6月份T含量迅速上升达到最大值。6月份血清性激素E2、T水平的迅速升高说明云纹石斑鱼亲鱼性腺快速发育，从外观可以观察到亲鱼腹部明显变大。9月时水体温度逐渐下降，无论是人工培育还是自然生长的亲鱼，如果性腺发育健全，前期营养储备充足，当达到适宜亲鱼产卵的温度时，雌鱼性腺可继续发育，迎来第二次产卵高峰。若是这一阶段水温持续降低，再次产卵很快就会结束，与其他石斑鱼相类似，云纹石斑鱼卵巢也会在一年内出现多次发育的情况[22-23]。

3.2 不同营养强化剂对亲鱼性类固醇激素的影响

虾青素作为营养强化剂添加于水产动物的饲料中，可以显著提高水产生物的生长性能，增强其等的免疫力，保护苗种抵御外界恶劣环境并促进其生长[24-25]。研究发现，蛙鱼育苗期摄食添加虾青素的饲料可以提高受精率并且促进卵的成熟、提高生殖力，减少胚胎死亡[26]。安振华等[27]指出，虾青素提高亲虾的繁殖力，饲料中虾青素添加量为20 g/kg时，可以显著提高抱卵率与抱卵量，同时提高幼虾的存活率及抵抗力。本实验中，云纹石斑鱼亲鱼经过4个月营养强化投喂，实验组亲鱼血清E2浓度明显高于空白对照组，这与刘付永忠等[12]对斜带石斑鱼的研究结果一致，而未添加营养强化剂的对照组E2含量明显低于添加强化剂实验组，说明在云纹石斑鱼亲鱼培育过程中，添加营养强化剂对繁殖期的亲鱼进行营养强化，对亲鱼性腺的正常发育会产生一定的影响。

各组亲鱼的血清T含量的变化，与罗海忠等[14]对鮸鱼亲鱼营养强化的结果一致，投喂结束时各营养强化组亲鱼血清T浓度显著高于对照组，说明繁殖前期对亲鱼营养强化对其性腺发育的重要性，如果不进行营养强化，可能会影响亲鱼卵巢末期的发育[28]，因此要想提高亲鱼的繁殖能力，必须在亲鱼性腺成熟前进行一系列的亲鱼营养强化培育。

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