猪瘟综合防控研究进展

任世斌，赵 亮，郭抗抗，林 青

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的高度传染性疾病，在亚洲、西欧、俄罗斯和南非等国家[1]都有报道。根据CSFV核酸序列可将其分为3个基因型，进一步可分为11个亚型，而对于核酸的一些保守序列与病毒毒力是否有一定的关联还有待研究。目前对于CSF的防控主要有疫苗手段和非疫苗手段。在中国，基于CSFV C株的弱毒疫苗广泛用于猪群CSF的预防，因而在国内很少有CSF大规模暴发的情况发生，但零星的感染还是不断出现。对于已经接种过疫苗的猪群，一些野生、非经典型的猪瘟还是无法完全避免，仍旧会导致猪只的异常甚至死亡[2]，猪瘟的防控依然任重而道远。

1 猪瘟病毒的致病机理

CSFV为有囊膜的单股正链RNA病毒，是黄病毒科瘟病毒属的成员。自然感染潜伏期为5 d～7 d，病程不一，短者2 d，最长可达21 d。CSFV可通过口腔和鼻腔黏膜进入宿主细胞，感染扁桃体部位的细胞，进而通过血液循环和淋巴循环传播到全身。CSFV对免疫细胞具有一定的偏好性，使感染猪胸腺、脾、淋巴结及骨髓中的白细胞大量凋亡。

CSFV基因组由3部分组成，包括5′非编码区(5'non-coding region，5′-NCR)、开放阅读框(open reading frame，ORF)和3′-NCR。其中ORF编码一个大的多聚前体蛋白，可被剪切为4个结构蛋白(C、Erns、E1和E2)、8个非结构蛋白(Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B),4种结构蛋白组成了病毒粒子，其他非结构蛋白在病毒的生命周期中发挥作用。

E1糖蛋白由195个氨基酸组成，大小约33 ku，含有3个N连接的糖基化位点和6个半胱氨酸残基。E1属I型跨膜蛋白，位于胞外的N端和疏水的C端使E1可以附着在病毒外被上，同源二聚体化后能够介导病毒侵入宿主细胞[3]。

E2也是一种糖蛋白，由373个氨基酸组成，大小约55 ku，含有6个N连接的糖基化位点，一个O连接的糖基化位点。N端的信号肽和C端的跨膜结构域使E2可以锚定在病毒表面，并可通过二硫键形成同源二聚体。E2是CSFV糖蛋白中主要的免疫原性蛋白，可诱导产生中和性抗体，引发机体的保护性免疫应答。

E2蛋白可与β肌动蛋白相互作用，影响CSFV的复制和侵染，E2蛋白糖基化虽不影响这一过程，但糖基化位点的异常可降低CSFV的免疫原性[4]。E2蛋白可与许多宿主细胞因子相互作用，影响CSFV黏附细胞的过程[5]，与之相关的宿主细胞因子已经确定，但CSFV上的功能性受体还未知，有待进一步研究。

Erns由227个氨基酸组成，大小为44 ku左右。Erns具有显著的RNA酶活性，既可在胞外发挥功能，也可被内吞入胞内发挥作用。一方面，Erns能够降解病毒的单链RNA，阻止病毒与pDC上的Toll样受体7(Toll-like receptor 7，TLR7)相互作用，影响抗原的提呈，从而促进病毒的增殖[6]。另一方面，Erns可与双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)结合，破坏TLR3的信号途径，从而干扰抑制干扰素Ⅰ(interferon Ⅰ，IFN-Ⅰ)的产生，阻碍宿主的早期免疫应答。

C蛋白分子质量约14.3 ku，含较多的碱性氨基酸，其N端被Npro、C端被宿主信号肽酶切割后，便从多聚蛋白体上释放，除影响宿主基因的表达外，还可在病毒 RNA的复制过程中发挥作用[7-8]。此外，该蛋白的小泛素相关修饰物(small ubiquitin-related modifier，SUMO)化修饰也可介导病毒的复制和免疫逃逸。

非结构蛋白(non-structural protein,NSP)与非编码区(NCR)的相互作用在调节RNA复制和翻译过程中发挥作用。NS3、NS4、NS4B、NS5A、NS5B对病毒基因组的复制都是必须的[9]。NS5A通过调节与NS5B和3′-NCR之间的作用来控制病毒RNA的合成。当NS5A含量较低时，优先与NS5B结合，促进病毒RNA的复制；但当含量较高时，则会与3′-NTR作用，抑制病毒RNA的复制。因此，CSFV可能通过NS5A的表达来调节RNA复制。

NS5B是一种RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)，与3′-NTR上的同源序列相结合后起始翻译过程。此外，NS5B与RNA的相互作用可增强NS5B N端RdRp活性。与细胞mRNA不同，CSFV基因组末端无5′帽子结构，内在核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)位于5′-NCR，可被核糖体识别并起始翻译过程。NS3可与IRES结合，促进IRES介导的翻译。与之相反的是NS5A能够抑制这一翻译过程，而NS5B可负调控与IRES结合的NS5A的功能。此外，NS5B还可刺激NS3，提高病毒基因组的翻译效率。干扰素诱导产生的Mx1蛋白能通过抑制NS5B来降低病毒感染[10]。

病毒进化出多种策略逃避宿主固有免疫应答，促进自身的复制。CSFV Npro蛋白与IFN调节因子3(interferon regulatory factor-3，IRF-3)或IRF-7相互作用，能够降低Ⅰ型干扰素(IFN-Ⅰ)的表达水平，从而促进病毒的感染。宿主细胞多聚胞嘧啶结合蛋白1(polycytosine binding protein 1，PCBP1)、血红蛋白β亚基(HB)同样能够负调节IFN信号通路，促进CSFV的增殖。研究表明，硫氧还原蛋白(thioredoxin，Trx)2与E2相互作用，可通过核转录因子-κB(NF-κB)信号通路抑制CSFV的复制，因而CSFV阻碍Trx2表达，干扰宿主细胞的抗病毒反应[11]。另有发现，丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)2与E2互作，可通过减弱c-Jun氨基端激酶(JAK)信号通路增强CSFV的复制[12]。

急性CSF通常引起发热、白细胞增多、血小板减少和出血等。急性CSFV感染，会导致IFN-Ⅰ水平异常，释放多种促炎性细胞因子。强烈的IFN-α应答与淋巴细胞的耗损有着直接关系。此外，IL-1α、IL-6和肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor α，TNF-α)是引发血小板减少的主要细胞因子，CSFV感染还可诱导Fas等凋亡基因的表达。

病毒Npro和NS2都可抑制宿主细胞的凋亡。Npro是一种多功能的蛋白，能够抑制双链RNA诱导的凋亡，但对由CSFV的NCR诱导的凋亡没有作用[13]。NS2的表达会导致细胞周期停留在间期(S期)，引发内质网应激反应。CSFV引起的凋亡可能与大量细胞因子的产生有着密切关系。

2 猪瘟诊断技术

对猪瘟的诊断方法有许多种，包括酶联免疫吸附试验、间接血凝试验、间接免疫荧光抗体技术、兔体交互免疫试验、反转录-聚合酶链反应、病毒分离鉴定等。其中，间接血凝试验操作简单，能测出抗体水平高低，被检血清在4log2以上者为免疫合格；免疫荧光试验也可检测猪瘟病毒的分布，结果直观，但检测的灵敏度不高；兔体交互免疫试验准确可靠，试验条件要求不高，但步骤复杂，所需的时间也比较长；反转录-聚合酶链反应无法定量动物体内的感染量，且容易受到污染；病毒分离鉴定无法定量，且耗时很长。

2.1 反转录PCR

RT-PCR基本可满足实验室对CSFV和非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)的检测需求，但由于这两种病毒在地理分布和引发临床症状方面高度相似，该方法并不能对它们有效的进行区分，易出现假阴性的结果。进一步研究发现，将单核苷酸提取法与实时RT-PCR联合使用，能够有效分辨CSFV和ASFV，该试验不仅适用于常规猪病毒病的诊断，还能够分别对CSFV和ASFV在4.9和22个拷贝量时进行检测，且其敏感性有保证，与多重TaqMan探针标记的RT-PCR(RT-nPCR-TaqMan)相当，对CSF的诊断特异性可达到100%，ASF则为97.3%，检测的过程也更加标准化。能够有效满足临近地域CSFV和ASFV快速鉴别诊断的技术需求[14]。

2.2 基于SYBR Green Ⅰ的实时荧光定量PCR

实时荧光定量RT-PCR技术的发展使对RNA的检测更加快速普遍，有效避免了常规RT-PCR扩增DNA时易于污染的缺点，能够在DNA复制过程中监测复制子的集聚情况，得到广泛的应用。但是此类方法大都使用TaqMan探针，因而无法实现连续的监测。

基于核酸染料SYBR Green I的实时荧光定量RT-PCR有效的解决了这个问题。由于SYBR Green Ⅰ与核酸变性相关，故可导致荧光信号的减弱。因此，利用相关软件对荧光信号的强弱变化进行分析，即可实现CSFV的持续监测。且检测的病毒cDNA拷贝数范围较广，每次反应可检测103～1011或102～1011的拷贝，敏感性和特异性都显著优于常规RT-PCR。基于SYBR Green Ⅰ的实时荧光定量PCR是一种省时、易于操作、敏感性强、特异性高、重复性好的检测方法，是实现CSFV长期监测的有力工具。

2.3 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)由Notomi等报道，优点在于操作简单、节省时间，可用于CSFV的核酸检测。相较于病毒分离和实时RT-PCR，LAMP法更适于实践，因为该方法无需昂贵设备支持，诊检测结果与浊度相关，用肉眼可直接观测。该方法近几年得到了极大地发展，LAMP的产物可用异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)、地高辛(digoxin，DIG)等小分子进行标记，进而用侧向流动试纸的方法来实现分离。试纸上包被着能够与小分子标记物特异性反应的抗体，当两者作用时，试纸上会出现彩色的阳性反应条带；联合侧向流动试纸的LAMP(LAMP-LFD)试验，更能够满足在野外或农场快速诊断的需求[15]。该方法与反转录PCR结合后，可实现CSFV RNA的检测，敏感性与实时RT-PCR相同。

2.4 DNA芯片技术

DNA芯片是将特定的DNA通过共价或非共价的方式固定在某一载体表面，利用核酸杂交而实现检测的目的。其能够在短时间内读取大量的信息，操作便捷，多用于病毒的鉴定，如CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)和流感病毒等[16]。DNA芯片极少出现非特异性的相互作用，从而减少了非靶向扩增的RNA，大大提高了特异性。但由于表面高密度固定探针的随机排列，该方法诊断的敏感性和有效性较低[17]。

当DNA芯片上添加9个连续的腺嘌呤(9A)时，荧光强度可达到最大。基于这些发现，新型的CSFV DNA芯片添加了9个腺嘌呤，这些分子在固定的探针之间产生一定的侧向间距，提高了探针的可接近性，使靶向特异性杂交的特异性和敏感性达到100%。经CSFV DNA芯片鉴定的基因型与核酸序列分析的结果一致性高。

2.5 酶联免疫吸附试验

目前已有多种类型的ELISA方法用于CSFV的检测，其中一些也已经商业化生产，如间接ELISA。用全病毒作为抗原的捕获ELISA和竞争ELISA(competitive ELISA，C-ELISA)等。间接ELISA通过建立对CSFV 血清抗体的检测方法对临床的E2蛋白多个抗原表位进行检测，应用广泛。Lorena等发现，ELISA可在感染后13 d内检测出患病猪只血液或脾脏样品中是否含有CSFV(C株)疫苗毒，RT-PCR则需要至少在感染后16 d才能确定。

C-ELISA是基于CSFV E2重组蛋白，通过抗原抗体相互作用实现。C-ELISA的敏感性97%，特异性100%。中和过氧化物酶联试验(neutralization peroxidase chain test，NPLA)曾作为衡量C-ELISA检测水平高低的“金标准”，其敏感性与噬斑试验相当。可对约70%～80%感染CSFV 3周的猪群体内的抗体进行检测。试验证明C-ELISA的敏感性和特异性与上述几种方法差异不大。C-ELISA与NPLA的相对特异性和灵敏度分别可达100%和86%，表现出NPLA和C-ELISA之间极好的相关关系。虽然C-ELISA敏感性不如NPLA，但增加样品数量可以解决这一问题。C-ELISA是CSFV大规模筛查的有力工具。

由于CSFV在基因构成和结构上与牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)相似，也有用BVDV的E2蛋白研制CSFV ELISA检测方法的报道[18]，敏感性和特异性都较高，可以作为一种低成本大规模检测的方法。

猪瘟病毒也可在患病动物的唾液-鼻液等分泌液中检出。Dietze K等[19]开发出的利用棉绳对猪群体唾液采样作为病毒早期检测技术，在其试验研究中收到了良好的效果。所有的测试动物都能在感染后7 d～15 d内从唾液中检测出CSFV的核酸。考虑到养猪业的不断规模化、集群化发展，这种群体规模的简易快捷方法可能会成为未来的重要检测方法。

其他方面的研究也可以提供诊断研究参考，如纳米DNA探针检测PCV技术。其试验展现出DNA探针比常规PCR和实时PCR更好的效果，对潜伏期的病例也能有效的进行检测，并且没有抗体检测方法中会出现的假阳性的情况[20]。随着更加高效便捷的基于细胞内转录的反向遗传方法获得cDNA的技术的出现[21]。

3 猪瘟的防控

3.1 传统兔化弱毒疫苗

第1代抗CSF的疫苗是在1936年利用病毒和猪高免血清混合制备的，但其安全性低且仅可用于初次免疫。目前最常用的疫苗皆由C毒株衍生而来，C株兔化弱毒疫苗具有显著的效力，单次接种4 d就可提供有效的保护，连续的口服免疫也可使机体对CSFV具备半年甚至终身的抵抗力，并且这些用于免疫的毒株对所有物种都是安全的。采用C毒株疫苗免疫的猪体内的互补决定区3(complementarity determining region 3，CDR3)谱型呈现出动态变化，且T细胞受体(T cell receptors，TCRs)AV5S/8-3S/8-4S/14/38 and BV4S/6S/7S/15S/30基因家族的克隆也得到增强[22]。C毒株疫苗可诱导Th2细胞应答，从而产生特异性抗体。疫苗毒株的复制速度非常低,注入后使机体对TLR的表达调控失常，过表达的TLR引发固有免疫应答系统用以清除疫苗。同时，免疫系统产生的白介素诱导B细胞的分化和特异性抗体的产生[23]。这类疫苗除了缺少表型DIVA区别(differentiation of infected from vaccinated animals)的标志，几乎满足了完美疫苗的所有要求。

传统疫苗可以作为衡量免疫效力的标准，但只有具备DIVA的新型疫苗才能为改进消除病毒的策略提高参考。就CSFV疫苗而言，不同的免疫方案需要的疫苗也有所差异。理想的疫苗不但要具备DIVA，还要有较强的稳定性，易于生产，低消耗，能够引发强烈甚至终身的免疫，且对接种动物来说没有副作用。

3.2 生物技术疫苗

3.2.1 DNA疫苗 目前DNA疫苗的雏形都是基于构建表达CSFV E2糖蛋白的质粒。其标记性仍旧依据Erns或NS3特异性抗体的检测。有时可共表达一些编码细胞因子(如IL-3、IL-12和IL-18)或调节性细胞表面分子CD154的基因，用于提高其免疫原性。研究表明，CD81可增强其免疫应答[24]。然而,为了保护猪群抵御强毒株的入侵，较高的使用剂量和多样化的免疫方案仍旧不可或缺。总而言之，DNA疫苗的高制备消耗和低传送效率，使得这一方法对免疫猪群来说不够经济实惠。

3.2.2 病毒载体疫苗 自20世纪90年代以来，病毒载体疫苗的研究常用牛痘病毒和伪狂犬病病毒。此外，还有猪和人的腺病毒载体，猪痘病毒载体，副痘病毒载体以及禽痘病毒载体等多种其他的病毒载体系统可供选择。禽痘病毒属的病毒只能在禽类体内有效复制，因而不能有效感染脊椎动物。多数情况下，病毒载体表达CSFV E2蛋白。E2糖蛋白或Erns重组牛痘病毒疫苗能够对致命感染量的CSFV提供保护，不过需要静脉注射高滴度的疫苗。对腺病毒载体疫苗的进一步研究发现，使用含有CSFV E2基因的裸DNA和重组猪腺病毒分别进行初级免疫和次级免疫，都能够有效诱导已经断奶的猪群产生保护性免疫应答，而对处于断奶期前的猪群则只能使约75%得到保护[25]。

Li J L等发现，共表达小肠结核耶尔森氏菌侵袭素的C端结构域能够有效加强腺病毒载体CSFV疫苗的效果。目前，一种新型的二价伪狂犬病病毒/CSFV标记疫苗已经研发，利用伪狂犬病病毒的突变体作为载体与CSFV E2制备的重组疫苗，能够同时预防伪狂犬病和CSF[26]。另一种HAdV-5(rAdV-E0-E2-IL2)的重组人腺病毒疫苗，可表达CSFV E2、CSFV Erns和IL2，两次高滴度间隔3周的肌肉内注射能够确保个体不受CSFV强毒株的伤害[27]。

此外，也可用CSFV疫苗做载体，导入其他病毒的序列。如将猪圆环病毒2型的Cap基因导入经典的C株疫苗中，来预防猪瘟病毒与猪圆环病毒2型的混合感染。但试验中并没有成功诱导产生对Cap的抗体，仅有对猪瘟部分的保护相对完善[28]。

上述提到的部分疫苗能够提供完全保护，然而有些疫苗可靠的免疫试验数据仍旧较为缺乏，尤其是在机体对于病毒载体的免疫应答方面。特定载体的使用可能会干扰血清监测系统，如伪狂犬病病毒载体的使用会导致伪狂犬病病毒逃逸监视。

3.2.3 基于蛋白质和肽的疫苗 E2亚单位疫苗是研发出的第一种具备DIVA的疫苗。纯化的CSFV E2糖蛋白能够诱导保护性免疫应答。这类亚单位疫苗含有重组CSFV E2，由杆状病毒在昆虫细胞内表达所得。在进行ELISA鉴定时，受野生型病毒感染的动物可与针对Erns的特异性抗体呈阳性反应，而免疫过的动物仅与针对E2的特异性抗体反应。

E2亚单位疫苗的安全性得到了证实(或称在某些情况下有轻微的局部反应)，但由于攻毒和免疫研究结果不稳定，它的效力无法与C-株疫苗或其他减毒活疫苗相类比。为了确保产生抗CSFV横向和纵向感染的有效免疫应答，需要不经肠的免疫途径，且疫苗的剂量要加倍，这也意味着该类疫苗无法口服。现在只有一种含油包水佐剂的CSFV E2糖蛋白亚单位疫苗在欧洲市场上市[29]。

近年来，使用多种表达载体来增强E2亚单位疫苗效果的研究越来越多，如经腺病毒转导以获得包含E2糖蛋白胞外结构域，并且带有组氨酸标签的疫苗。该表达系统最大的优势在于保持了E2糖蛋白完整的四级结构。有报道称，这一疫苗能够在CSFV感染早期，诱导机体产生长期有效的保护性免疫应答，与此同时，共表达人的α干扰素可增强其免疫原性。酵母表达系统表达的E2蛋白，在两次接种后同样能够诱导有效的免疫应答，且具备基于Erns特异性抗体的DIVA。目前已有能够稳定表达CSFV E2蛋白的转基因哺乳动物细胞系，如腺病毒转导的PK-15细胞产生的E2蛋白，在联合佐剂进行免疫后，可引起强的抗CSFV应答[30]。

除了E2亚单位疫苗以外，覆盖CSFV E2糖蛋白不同区域的单肽或多肽疫苗也成为了研究的热点。与亚单位疫苗相同，肽疫苗因为不含有可复制性的病毒而具备较高的安全性，但其需要与佐剂连用，并经肠胃才可发挥免疫效应。多数研究表明，大部分情况下，合成肽能够引起一定水平的中和抗体的产生，却无法形成对临床疾病、毒血症和排毒的完全保护。肽疫苗均不能引发抗CSFV感染的完全保护，即便是串联重复的多表位疫苗也仅能确保部分保护，且其制备难度要大于E2亚单位疫苗。

其他蛋白能否用于亚单位疫苗的制备仍在研究，如重组NS3蛋白虽然能够刺激机体产生特定的免疫应答，但对于严重的感染却没有保护作用。

3.3 免疫防控

猪瘟病毒的免疫主要由CD8+T细胞实现。在Giulia的蛋白质组扫描试验中，所有接种动物在5 d～28 d后都得到了保护，没有出现白细胞减少或其他症状；接种疫苗的猪只都表现出CD4-CD8+和CD4+记忆细胞的激活状态，并且均有γ干扰素分泌增加的现象[31]。虽然每一个个体的状况各不相同，但其免疫过程却都类似。

不仅是IFN-γ，IFN-α也能对CSFV起到抗病毒效果。相较于长期持续性的IFN-α反应，短期的IFN-α反应更有利于CSFV的免疫。Fernandez-Sainz I等[32]对IFN-α对抗CSFV的作用进行了研究，发现转基因的胎猪肾细胞(fetal porcine kidney,EPK)表现出了对CSFV的抗病毒活性，并且会因IFN-α的亚型不同而产生较大范围的差别。

目前常用的联合免疫有“332法”和“321法”。“332法”即先用FMD和CSF疫苗同时在颈部分两侧注射，间隔14 d后再用高致病性猪繁殖与呼吸综合征(highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome，HP-PRRS)疫苗注射。“321法”即将CSF和HP-PRRS疫苗混合后作一针在颈部一侧注射，FMD疫苗作一针在颈部另一侧注射。有研究显示，相比之下“321法”HP-PRRS免疫密度、散养猪CSFV和HP-PRRSV抗体阳性率、屠宰猪HP-PRRSV抗体阳性率均显著增加，散养猪死淘率、HP-PRRS阳性率均显著下降，而其他主要考核指标则差异不显著[33]。这一结果表明，应用“321法”免疫程序的免疫效果优于“332法”。

有研究指出，因为长期使用基因1型的疫苗，现在CSFV的流行株基因型逐渐向突变体和基因2型转变[34-35]，这种作为一种野毒在人为选择过程中的进化结果，也是免疫失败出现的原因之一，而免疫失败后暴发的CSF促进了宿主动物体内CSFV的进化。尽管调查的数据可能存在一些问题，而使得结果有争议[36]，这种风险在长期使用相对单一基因型的疫苗情况下是确实存在的，因而其免疫与防控可能面临新的挑战。

4 展望

猪瘟因其传染性、接触性及高度的致病性和致死性，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。目前对于猪瘟的研究，多侧重于诊断技术，而致病机理方面则相对薄弱，猪瘟病毒的组成、如何感染细胞、信号通路的变化都还认知有限，而其很高的变异性更是加大了防控的难度。因此，深入研究其分子构成，确定影响其毒力的关键因子，对于研发高效、持久、多样的新型疫苗，如表位疫苗、亚单位疫苗等，促进猪瘟的防控有着重要意义。