羊源肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定

谢宇舟，吴翠兰，李 军，陶 立，李常挺，彭 昊，马春霞，潘 艳

（广西兽医研究所/广西兽医生物技术重点实验室，广西南宁530001）

克雷伯氏菌属为肠杆菌科的成员，有肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和土生克雷伯氏菌这4个种[1]。肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）是一种条件性致病菌，可引起肺炎、子宫炎、腹泻等疾病[2]。随着养殖规模的不断增大，由肺炎克雷伯氏菌引起的疾病致死率较高，它不仅给养殖行业造成巨大的经济损失，也严重危害人类的健康。

2017年8月，我们对死亡黑山羊的检测中分离到1株肺炎克雷伯氏菌，现将病原菌的主要特征报告如下。

1　材料与方法

1.1　病料

采集自广西某山羊场病死羊的肺脏。

1.2　细菌分离

取病死羊的肺脏在无菌操作工作台接种于麦康凯平板上，放置在37℃恒温箱培养24h后观察细菌生长情况。然后挑取单个菌落进行革兰氏染色、镜检和肉汤培养。

1.3　细菌生化试验

将分离到的细菌接种于微量生化反应管，放置在37℃恒温箱培养24 h后观察细菌生长特性，在《临床常见细菌、真菌鉴定手册》[3]进行比对。

1.4　细菌16S rRNA基因测序和分析

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌的DNA，应用16S rRNA细菌鉴定引物进行PCR扩增，经电泳、回收、克隆、测序。并对测序结果进行分析。

1.5　细菌致病性试验

取12只健康小白鼠均分为两组，每组各6只，分别为试验组和对照组。试验组小鼠的攻毒剂量为0.3mL/只（浓度为2×108 CFU/mL），对照组则注射等量的生理盐水。然后继续培养，观察小鼠的身体状况。

1.6　药敏试验

采用纸片琼脂扩散的方法进行药敏试验，药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司，按照该公司试验标准进行操作，然后放置在37℃恒温箱培养12～24h后，观察抑菌圈情况。

2　结果

2.1　细菌分离和鉴定

将肺组织划线接种于麦康凯平板上，置于37℃培养24h后，菌生长良好，菌落颜色为红色。菌落有点黏稠，挑取单个菌落时具有拉丝现象，经镜检为革兰氏阴性、短杆菌。

2.2　细菌生化鉴定

分离株的生化特性结果V-P试验、枸橼酸盐、葡萄糖、乳糖、尿素酶试验均为阳性；吲哚、甲基红和明胶水解试验为阴性（表1）。该生化特性结果与《临床常见细菌、真菌鉴定手册》的克雷伯氏菌属肺炎克雷伯氏菌的生化特性相符合。

表1　药敏试验结果

2.3　分离菌16S rRNA扩增和测序分析

该分离株经PCR扩增、电泳，得到了相应的目的片段（图1）。将PCR扩增产物送测序公司进行测序。用生物学软件对该分离株的测序结果进行分析，得到了长为1438 bp的片段，命名为GXSL。

图1　分离株16S rRNA扩增电泳图

用MegAlign对9株肺炎克雷伯氏菌参考株和GXSL分离株进行核苷酸同源性比较，结果GXSL与肺炎克雷伯氏菌的同源性在97.1%以上（图2）。

用MEGA7用MegAlign对9株肺炎克雷伯氏菌参考株和GXSL分离株进行核苷酸进化树分析，该分离株与肺炎克雷伯氏菌在同一分支上（图3）。

以上分析结果表明，获得的GXSL分离株为肺炎克雷伯氏菌。

2.4　分离菌的致病性试验

实验组接种分离菌5h后开始表现为精神沉郁、不好动，24h内小鼠死亡4只，在48h内6只小鼠全部死亡，死亡率为100%，而对照组小鼠表现正常。将死亡小鼠进行解剖发现心和肺严重出血，肝有坏死点。将小鼠病变组织在麦康凯平板进行划线、培养，回收到与接种菌一样的细菌。

图2　氨基酸同源性比较

图3　核苷酸进化树

2.5　药敏试验

药敏试验结果显示该菌对头孢噻肟、阿米卡星、头孢曲松和链霉敏感，对强力霉素、庆大霉素、青霉素G、氧氟沙星、蒽诺沙星、卡那霉素、复方新诺明、诺氟沙星、阿奇霉素、多粘菌素B、利福平和环丙沙星这12种药物耐药（表2）。

表2　药敏试验结果

3　分析讨论

近年来，肺炎克雷伯氏菌已成为危害人类和动物的重要条件致病性菌之一[4]。肺炎克雷伯氏菌首先是从病人的大叶性肺炎中分离到的；在动物界中，滕涛等[4]从团头鲂的溃疡处和肝脾病灶部位、彭智伟等[5]从水貂肝脏病变组织、王孝友等[6]从兔的肺肝等病变组织、贺番等[7]从奶牛乳房炎中分离到肺炎克雷伯氏菌，这些研究表明，由肺炎克雷伯氏菌感染的动物逐渐增多，该病原已成为备受关注的人兽共患病病原。

本研究从病死羊的肺脏中分离到1株革兰氏阴性短杆菌。生化试验鉴定结果V-P试验、枸橼酸盐、葡萄糖、乳糖、尿素酶试验均为阳性；吲哚、甲基红和明胶水解试验为阴性。该菌的形态特征和生理生化特性均与肺炎克雷伯氏菌相符合，初步判定为肺炎克雷伯氏菌。

由于16S rRNA基因具有细菌属、种的特征，现已被用来作为细菌鉴型的依据[1]。本研究对分离株GXSL和9株肺炎克雷伯氏菌参考株基于16S rRNA基因的核苷酸同源性比较和核苷酸进化树分析，结果表明分离株GXSL与肺炎克雷伯氏菌的同源性在97.1%以上；核苷酸进化树分析显示，该分离株与肺炎克雷伯氏菌在同一分支上，这更进一步说明该分离株为肺炎克雷伯氏菌。由此可见，对于细菌的分离鉴定我们需要借助于传统的分离鉴定方法和新型的分子生物学方法相结合，所得的结果更加可靠。

肺炎克雷伯氏菌是致病性强的病原菌，陈兴生等[8]从死牛体内分离到毒力较强的肺炎克雷伯氏菌；冯娜等[9]报道接种肺炎克雷伯氏菌的小鼠在24h全部死亡。而本研究在致病性试验中，该分离株也使小白鼠100%致死，并使小白鼠出现心和肺严重出血、肝有坏死点等症状，说明本试验分离株GXSL的致病性也很强。由于肺炎克雷伯氏菌致病相关毒力因子比较多，因此，其毒力基因的确定还要待进一步的研究。

本试验还对该菌进行药物敏感性试验，分离出4种较敏感的药物：头孢噻肟、阿米卡星、头孢曲松和链霉敏感，其余对强力霉素等12种药物耐药，这试验结果与冯娜等[9]的报道结果基本一致。这种耐药性的产生可能由于各种抗菌药物的广泛使用，加之，肺炎克雷伯氏菌可以产生各种使抗生素失活的酶，从而导致耐药性的普遍存在[10]。

本研究通过微生物学手段和分子生物学技术从病死羊的肺脏中分离鉴定出1株肺炎克雷伯氏菌，并成功筛选了几种较敏感性药物，为治疗和预防该菌对羊的危害提供可靠的数据。

[1]房海，陈翠珍，张晓军，等.羊肺炎克雷伯氏菌感染症及病原菌检测与系统发育分析[J].中国人兽共患病杂志，2005,21(10)：895-899.

[2]周玉龙，李国军，李阳，等.奶牛肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定[J].中国奶牛，2007,(6)：36-38.

[3]陈瑜.临床常见细菌、真菌鉴定手册[M].北京：人民卫生出版社，2009：68-69.

[4]滕涛，梁利国，谢骏，等.团头鲂源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定[J].水生态学杂志，2016,37(6)：95-99.

[5]彭智伟，张长生，梁宇翔，等.水貂肝脏中肺炎克雷伯氏菌的鉴定[J].黑龙江畜牧兽医，2016(01)：148-149.

[6]王孝友，王永康，杨睿，等.兔肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定[J].中国养兔，2011,4：10-18.

[7]贺番，贺瑜，孟宁生，等.奶牛乳房炎克雷伯氏菌的分离鉴定[J].畜牧兽医柯基信息，2015,11：19-21.

[8]陈兴生，叶育桐.牛肺炎克雷伯氏菌的分离和鉴定[J].中国兽医杂志，1997,23(3)：13.

[9]冯娜，高翔，肖敏，等.牛源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及遗传进化树分析[J].中国兽医科学，2016,46(11)：1358-1364.

[10]王召朋，柴同杰，牟特，等.青岛地区兔肺炎克雷伯氏菌分离鉴定[J].山东畜牧兽医，2012,33(5)：16-18.