宏基因组测序分析人参内生细菌组成及多样性

郭伟强， 钱　玮， 胡翠英， 陈子欣， 仲汇银， 鞠　鑫

(苏州科技大学化学生物与材料工程学院，江苏苏州 215009)

人参，属五加科植物，在我国有数千年的药用历史，是传统名贵药材。人参具有调气血、安精神、止惊悸等功效。近年来，现代药理扩大人参的应用范围和价值，研究发现人参具有抗肿瘤、抗炎症、抑菌等多种作用[1-2]。人参有效成分主要集中于人参皂苷、多糖等，如人参皂苷Rg1、Rg3、Rh2、Re等。人参皂苷Rg1通过抑制AMPK/mTOR/PI3K通路减少血管紧张素Ⅱ诱导足细胞的自噬现象[3]；人参皂苷Rg3下调胰岛素一号增长因子的分泌，抑制骨髓瘤细胞增殖[4]；人参皂苷Re在人永生化表皮细胞HaCaT中，能够调控丝蛋白和半胱天冬 酶-14促进皮肤的保护功能[5]；人参皂苷Rh2在结肠癌荷鼠抑制瘤模型中能够减轻肿瘤相关抑郁症状[6]。

野生人参多分布于黑龙江、吉林、辽宁等地区，随着人参种植技术的发展，栽培人参已在湖北、河南、河北等地区落户。虽然人参的种植规模在扩大，但依然处于供不应求的状况。此外，病虫害、天气等因素也严重影响人参的产量和品质[7]。

内生菌是一类可以在植物体内生存的微生物，且不会对宿主植物造成任何伤害。因其次生代谢产物中可能含有与宿主植物相同或相似的活性成分，而成为研究的热点和重点[8]。因此，本试验以非主产地栽培人参为研究对象，分析其内生细菌的组成和多样性，以期为更好地开发利用有限的人参资源提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

人参为吉林长白山野生人参(购自安徽省亳州市中药市场)和河南省南阳市栽培人参(由河南省南阳市栽培户馈赠)；细菌总DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司；宏基因组测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

营养琼脂(NA)培养基：10.0 g蛋白胨，3.0 g牛肉粉，5.0 g 氯化钠，双蒸水定容至1 L，pH值调至7.3。

1.2　试验方法

1.2.1人参表面消毒及培养新鲜人参根茎经自来水冲洗后，用50%乙醇处理15 s，75%乙醇处理30 s。随后，将人参于1% NaClO溶液中浸泡3 min，无菌水冲洗3～5次，收集冲洗废液。将人参根茎剪成5 mm的小段置于NA液体培养基中，28 ℃，100 r/min培养14 d左右。

1.2.2人参内生细菌总DNA提取取5 mL上述培养液，1 000 r/min 离心1 min后，在菌体沉淀中加入200 μL缓冲液GA和20 μL蛋白酶K，振荡；加入220 μL缓冲液GB，振荡 15 s 后70 ℃水浴10 min；加入220 μL无水乙醇，振荡15 s，转至吸附柱中，随后按说明书进行操作。使用紫外微量分光光度计检测所提DNA的浓度和质量。

1.2.3宏基因组测序及数据分析利用细菌16Sr DNA引物338F(5′-ACTCCTACGGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′)，进行PCR扩增。产物经胶回收后，使用Illimina PE250/PE300进行宏基因组测序。

测序所得有效数据进行OTUs(operational taxonomic units，简称OTUs)聚类分析，使用Greengene数据库进行物种注释，对OTUs进行丰度和Alpha多样性分析。

2　结果与分析

2.1　测序结果及分析

由图1可知，随着测序数量的增加，稀释度曲线趋向平坦。香农指数(图2)说明测序数据丰富，能够反映人参内生细菌中的物种信息。

2.2　人参内生细菌的多样性分析

由图3、图4、图5可知，在门的分类水平上，人参内生细菌多分布在变形菌门(Proteobacteria)、硬壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)等门中，其中，野生人参内生细菌在上述门中的含量分别约为64%、29%、7%，栽培人参内生细菌在上述门中的含量分别约为56%、40%、4%。在纲的分类水平上，人参内生细菌多分布于放线菌纲(Actinobacteria)、α-变形菌纲(Alpha-proteobacteria)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、β-变形菌纲(Beta-proteobacteria)、γ-变形菌纲(Gamma-proteobacteria)等纲中，其中，野生人参内生细菌在上述纲中的含量分别为 7%、14%、29%、7%、43%，栽培人参内生细菌在上述纲中的含量分别约为4%、16%、40%、8%、32%。在目的分类水平上，人参内生细菌主要分布在芽孢杆菌目(Bacillales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、肠杆菌目(Enterobacteriales)、微球菌目(Micrococcales)、假单胞菌目(Pseudomonadales)、根瘤菌目(Rhizobiales)、黄单胞杆菌目(Xanthomonadales)等目中，其中，野生人参内生细菌在上述目中的含量分别为29%、7%、14%、7%、14%、14%、14%，栽培人参内生细菌在上述目中的含量分别为40%、8%、12%、4%、12%、16%、8%。在科的分类水平上，野生人参内生细菌主要分布在产碱菌科(Alcaligenaceae)(7%)、布鲁氏菌科(Brucellaceae)(7%)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(14%)、微杆菌科(Microbacteriaceae)(7%)、类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)(21%)、动性球菌科(Planococcaceae)(7%)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)(14%)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)(7%)、黄单胞杆菌科(Xanthomonadaceae)(14%)等科中；栽培人参内生细菌则多集中在产碱杆菌科(Alcaligenaceae)(8%)、芽孢杆菌科(Bacillaceae)(4%)、慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae)(4%)、布鲁氏菌科(Brucellaceae)(4%)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)(12%)、微杆菌科(Microbacteriaceae)(4%)、莫拉菌科(Moraxellaceae)(4%)、类芽孢杆菌科(Paenibacillaceae)(28%)、动性球菌科(Planococcaceae)(8%)、假单胞杆菌科(Pseudomonadaceae)(8%)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)(4%)、未分类根瘤菌科(Rhizobiaceae-unclassified)(4%)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)(8%)等科中。从属的分类水平来看，野生人参内生细菌在无色杆菌属(Achromobacter)(7%)、肠杆菌属(Enterobacter)(7%)、赖氨酸芽孢杆菌属(Lysinibacillus)(7%)、微杆菌属(Microbacterium)(7%)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)(7%)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)(21%)、假单胞菌属(Pseudomonas)(14%)、根瘤菌属(Rhizobium)(7%)、沙雷菌属(Serratia)(7%)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)(14.%)等属中均有分布；栽培人参内生细菌多集中于无色杆菌属(4%)、不动菌属(Acinetobacter)(4%)、颇陌菌属(Advenella)(4%)、芽孢杆菌属(Bacillus)(4%)、包西氏菌属(Bosea)(4%)、肠杆菌属(4%)、赖氨酸芽孢杆菌属(4%)、微杆菌属(4%)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)(4%)、类芽孢杆菌属(28%)、泛菌属(4%)、假单胞菌属(8%)、未分类根瘤菌属(Rhizobium-unclassified)(4%)、根瘤菌属(4%)、沙雷菌属(4%)、寡养单胞菌属(8%)、绿芽孢杆菌属(Viridibacillus)(4%)等属中。上述数据显示，类芽孢杆菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌属在野生人参内生细菌和栽培人参内生细菌中均为优势种群。

3　结论与讨论

本研究以河南省栽培人参为代表，利用高通量测序技术进行16Sr RNA分析野生、栽培人参内生细菌的多样性。结果显示，在野性、栽培人参中内生细菌均具有丰富的遗传多样性，野生人参内生细菌含有类芽孢杆菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌属等10个细菌属；栽培人参内生细菌含有类芽孢杆菌属、寡养单胞菌属等17个细菌属。

该研究结果可以为深入研究， 开发人参内生细菌提供理论基础和参考依据。

16S rRNA具有10个保守区域和9个高变区域，其高变区域随种属的差异而有固定的差异序列，因此，16S rRNA在研究细菌分类和系统发育等方面被认为是金标准。

人参被称为“百草之王”，药用价值广泛，现代药理研究显示，人参具有抗肿瘤、抗炎症、增加免疫力等作用；但因价格、虫害等因素阻碍了人参的应用及推广。近年来，随着对内生菌研究的深入，人参内生菌中含有与人参功效相似的次生代谢产物，使人参内生菌成为热点研究领域之一[9]。田磊等从人参内生细菌中筛选到1株具有ACC脱氢酶活性的荧光假单胞杆菌[10]；王卓等发现2种人参内生真菌——GS-4和GS-22，其乙酸乙酯粗提物对人宫颈癌Hela细胞具有抑制作用，其半抑制浓度为60～140 μg/mL，这2种真菌分别为半裸镰刀菌、半球菌[11]；姜云等研究了来源于吉林省不同区域的人参内生细菌的多样性，发现人参内生细菌分属于18个种属[12]。虽然有关人参内生细菌的研究较多，但关于野生、栽培人参内生细菌的多样性及其之间的差异性等研究较少。作为人参内生细菌的差异性研究，本研究属于首次。

本研究分析栽培人参与野生人参细菌多样性的差异主要为，栽培人参细菌的丰度略高于野生人参细菌的丰度，栽培人参含有17个细菌种属，其中类芽孢杆菌属、寡养单胞菌属等为优势属。这为人参内生细菌的开发和应用奠定了理论基础，也为研究不同产地人参内生细菌的多样性提供参考依据和试验技术，对推广人参栽培具有积极意义。

参考文献：

[1]徐家翠. 人参化学成分的药理活性及其含量积累的研究性进展[J]. 药物与人，2015，28(1)：43.

[2]占颖，刘春生，刘洋洋，等. 人参和三七活性成分与药理作用对比研究进展[J]. 中国中医药科技，2014，21(6)：711-712.

[3]Mao N，Tan R Z，Wang S Q，et al. Ginsenoside Rg1 inhibits angiotensin Ⅱ-induced podocyte autophagy via AMPK/mTOR/PI3K pathway[J]. Cell Biology International，2016，40(8)：917-925.

[4]Li Y，Yang T，Li J，et al. Inhibition of multiple myeloma cell proliferation by ginsenoside Rg3 via reduction in the secretion of IGF-1[J]. Molecular Medicine Reports，2016，14(3)：2222-2230.

[5]Oh Y，Lim H W，Kim K，et al. Ginsenoside Re improves skin barrier function in HaCaT keratinocytes under normal growth conditions[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2016，80(11)：2165-2167.

[6]Wang J，Chen Y，Dai C，et al. Ginsenoside Rh2 alleviates tumor associated depression in a mouse model of colorectal carcinoma[J]. American Journal of Translational Research，2016，8(5)：2189-2195.

[7]邵天蔚，李勇. 利用生防微生物防治人参根部病害的研究进展[J]. 中国现代中药，2016，18(3)：383-386.

[8]Waterman C，Calcul L，Beau J，et al. Miniaturized cultivation of microbiota for antimalarial drug discovery[J]. Medicinal Research Reviews，2016，36(1)：144-168.

[9]潘晓曦，关一鸣，张舒娜，等. 人参内生菌研究现状与展望[J].人参研究，2014(3)：52-55.

[10]田磊，姜云，陈长卿，等. 一株人参内生1-氨基环丙烷-1-1羧酸(ACC)脱氨酶活性细菌的筛选、鉴定及其对宿主生长的影响[J]. 微生物学报，2014，54(7)：760-769.

[11]王卓，于慧美，刘鼎，等. 人参内生真菌的分离及其抗肿瘤活性研究[J]. 中国现代中药，2013，15(9)：748-751.

[12]姜云，尹望，陈长卿，等. 人参内生可培养细菌16S rDNA-RFLP分析[J]. 东北林业大学学报，2012，40(8)：34-39.