VITEK 2 Compact检测耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对阿米卡星药敏结果的准确性评价*

刘　云，万玉香，马　炜，李亚周，黄晓春，秦　琴

(海军军医大学第一附属医院实验诊断科，上海　200433)

肺炎克雷伯菌是肠杆菌科中常见的细菌，是造成医院内感染的重要病原菌。该菌可引起原发性肺炎，还能引起各种肺外感染，包括肠炎、脑膜炎、泌尿系感染及菌血症等[1]。近年来，随着碳青霉烯类抗生素的长期大量使用，导致耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem- resistant klebsiella pneumoniae，CRKP)逐年增多，给临床治疗带来极大困难，也为该菌在医院内感染的暴发流行带来隐患。

氨基糖苷类是临床上常用的一类抗菌药物，可与细菌30s核糖体亚单位的16s rRNA特异性位点不可逆结合，干扰蛋白质合成，从而阻止细菌生长。该类抗生素抗菌谱广、疗效卓越，是一种治疗革兰阴性菌感染，尤其是医院内感染的重要抗生素[2]。对于CRKP导致的感染，在治疗上可选择替加环素，和其他有体外抗菌活性的抗生素如头霉素类、β- 内酰胺类加酶抑制剂和氨基糖苷类等药物。临床医生用药方案的选择主要根据微生物室提供的体外药敏试验。因此，准确的体外药敏试验结果是临床治疗患者、控制医院感染的前提和关键。

目前，临床实验室常采用VITEK 2 Compact用于微生物鉴定及其抗菌药物的药敏试验，可以在较短的时间内完成，极大地缩短了检测周期，指导临床医生合理用药，使病人得到尽快有效的治疗。但是，较短的孵育时间也可能使一些药敏结果检测不准确性的风险增加。我们在临床工作中发现：采用AST- GN13卡在VITEK 2 Compact上检测，部分CRKP对几乎所有抗生素耐药，但是阿米卡星敏感，采用纸片扩散法(K- B法)检测时往往发现高度耐药(抑菌圈直径6 mm)。所以，为了对VITEK 2 Compact药敏检测结果的准确性进行验证，本研究对VITEK 2 Compact检测CRKP对阿米卡星药敏结果的准确性做了系统研究。

1　材料和方法

1.1菌株147株CRKP分离自上海长海医院2015年11月～2017年2月的各种临床标本，包括尿液、分泌物、痰、灌洗液、胸腹腔积液、血液、坏死组织、咽拭子、囊肿液、导管等。标本分布于临床各个科室。所有菌株为非重复菌株，均经过布鲁克MALDI- TOF质谱仪鉴定，质控菌株为大肠埃希菌标准菌株(ATCC 25922)。

1.2试剂与仪器VITEK 2 Compact 全自动微生物分析系统及其配套的AST- GN13药敏卡均为法国梅里埃公司产品。K- B法试验的药敏纸片购自英国OXOID公司，每片药敏纸片含阿米卡星30 μg。E- test药敏条购自法国梅里埃公司。药敏M- H平板本实验室自配。

1.3方法分别采用VITEK 2 Compact，K- B法和E- test法检测147株CRKP对阿米卡星的敏感度，实验操作和结果的判读按美国临床实验室标准化协会(clinical and laboratory standards institute，CLSI)文件(M100- S26)[3]进行。①VITEK 2 Compact：AST- GN13卡对阿米卡星MIC的报告范围为≤2 μg/ml或≥64 μg/ml。②K- B法：抑菌圈直径≥17 mm为敏感，15～16 mm为中介，≤14 mm为耐药。③E- test法：判断标准同VITEK 2 Compact，MIC≥64 μg/ml为耐药，MIC=32 μg/ml为中介，MIC≤16 μg/ml为敏感。以上方法均采用标准菌株大肠埃希菌(ATCC 25922)和铜绿假单胞菌(ATCC 27853)进行质量控制。

2　结果

2.1菌株来源147株CRKP中，分离自痰或灌洗液的有47株、分泌物的有40株、尿液标本的有26株、引流液9株、血液7株、导管5株，其它标本类型13株(包括胸腹腔积液、脓液、坏死组织、穿刺液等)。呼吸道、分泌物及尿液标本来源的CRKP总计113株，占总样本数的6.9%。147株CRKP来自全院各科室。其中，烧伤科监护室及烧伤科118株，重症医学科6株、普通外科4株、消化科4株，其他科室15株(包括神经内科、脑血管科、器官移植科、泌尿外科等)。以上结果显示80%的菌株来源于烧伤科监护室及烧伤科病区，具有相对集中的趋势。

2.2不同抗菌药物的敏感率见表1。147株CRKP经Vitek 2 Compact检测不同抗菌药物的药敏试验，对阿米卡星的敏感率为96.6%。

表1 147株肺炎克雷伯菌对不同抗菌药物的药敏率

2.3阿米卡星体外药敏试验结果147株CRKP对阿米卡星体外药敏试验结果显示：采用VITEK 2 Compact检测，敏感菌株有142株，中介有4株，耐药有1株；采用K- B法检测敏感菌株有4株，耐药143株；K- B法和E- test法药敏结果完全一致。其中，4株经VITEK 2 Compact法和K- B法检测阿米卡星药敏结果均为敏感；1株经VITEK 2 Compact法和K- B法检测阿米卡星药敏结果均为耐药；4株经VITEK 2 Compact检测阿米卡星药敏结果为中介，K- B法检测结果为耐药；138株经VITEK 2 Compact检测阿米卡星药敏结果为敏感，而K- B法检测结果为耐药，见表2。

表2147株肺炎克雷伯菌对阿米卡星体外药物敏感试验结果

K⁃B法VITEK2Compact敏感中介耐药合计敏感耐药合计41381420440114143147

采用VITEK 2 Compact检测，阿米卡星MIC≤2 μg/ml有33株，其中4株K- B法敏感，29株K- B法耐药；阿米卡星MIC为4～16 μg/ml有109株，K- B法均为耐药。阿米卡星MIC为32 μg/ml有4株，K- B法均耐药；阿米卡星MIC为≥64 μg/ml有1株，K- B法亦耐药，见表3。

表3147株肺炎克雷伯菌不同MIC浓度下K- B法的检测结果

VITEK2Compact法MIC(μg/ml)K⁃B法耐药敏感总菌株数≤2(S)4(S)8(S)16(S)32(I)≥64(R)29602623414000003360262341

3　讨论

肺炎克雷伯菌是临床常见的重要条件致病菌。感染肺炎克雷伯菌的患者，大部分进行过有创操作，包括气管插管、深静脉置管、胃肠减压、或者患有肠穿孔、肠梗阻等致肠道菌群可能出现明显异位的疾病[4]。近年来，随着抗菌药物的大量使用，多重耐药的肺炎克雷伯菌不断增加，因产生碳青霉烯酶或高产AmpC酶等耐药机制，导致对常用的碳青霉烯类抗菌药物耐药，临床治疗难度加大，病情迁延不愈[5～7]。这一现状越来越被临床医生、检验人员及感染控制专家所关注和重视[8]。

本研究结果显示，呼吸道、分泌物和尿液标本中分离的CRKP菌株比率较高。其中，分泌物全部来自烧伤监护室和烧伤病区患者的烧伤创面，这提示临床应进一步加强烧伤患者创面感染的控制，以减少CRKP感染播散引起的血流感染与脓毒症。烧伤患者CRKP的分离率高，与其免疫屏障受损、机体免疫力低下、气管插管、使用呼吸机等设施、长期使用抗生素和激素类药物有关。因此，烧伤病房控制感染的措施，除阶段性选择性减少碳青霉烯类抗生素的使用外，还要注意加强医疗器械的消毒，重视医护人员的无菌操作观念，以防医源性感染的出现及进一步流行。

本研究分别采用VITEK 2 Compact，K- B法和E- test法检测147株CRKP对阿米卡星的敏感性。结果显示，K- B法和E- test法结果完全一致，但与VITEK 2 Compact法有显著差异。分析原因可能是因为肺炎克雷伯菌对阿米卡星存在诱导性耐药。采用K- B法检测时发现阿米卡星纸片周围出现了双圈耐药现象，即抑菌圈与纸片之间出现一个生长圈，这与鲍曼不动杆菌研究中观察到的现象很相似[2，9]。有文献研究显示[10～12]，主要由于肺炎克雷伯菌存在氨基糖苷乙酰转移酶(AAC)耐药基因，并且该耐药基因可以被阿米卡星诱导而表达增加。因AAC等耐药基因的存在，氨基糖苷修饰酶的大量表达，抗生素被修饰后与细菌核糖体氨酰- tRNA的亲和力大大减弱，失去了干扰细菌蛋白质合成的能力，使细菌对氨基糖苷类药物产生抗性。另外，由于VITEK 2 Compact检测周期短，CRKP药物敏感性试验检测时间为6～8 h，并且可诱导耐药基因表达依赖特定浓度范围的阿米卡星，从而造成了VITEK 2 Compact检测值偏低。

阿米卡星是氨基糖苷类抗生素中抗菌活性较强的药物，其抗菌机制不同于碳青霉烯类抗生素。临床治疗CRKP感染时，常选择替加环素联合阿米卡星或其它体外具有抗菌活性的药物。但是，本研究中147株CRKP经VITEK 2 Compact检测，只有3.4%的菌株阿米卡星的药敏结果是准确的。VITEK 2 Compact检测CRKP对阿米卡星的假敏感率非常高，尤其是在MIC为4～16 μg/ml时，假敏感率竟达100%。这说明VITEK 2 Compact检测CRKP对阿米卡星的敏感菌株中，大部分菌株并不是真的对阿米卡星敏感。目前我们无法根据阿米卡星的折点，判断菌株是否携带AAC基因，这就需要我们在临床工作中关注CRKP菌株，特别是阿米卡星特定浓度范围内药敏结果的准确度。

综上所述，本研究证实VITEK 2 Compact全自动细菌分析仪检测CRKP对阿米卡星的敏感性时结果不可靠。微生物实验室在使用该仪器检测CRKP对阿米卡星的药物敏感性时，需要用其他方法如K- B法或Etest法等进行验证后，方可给临床发出最终报告。

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