邓世群,赵世元,张帮献
(1.广西南宁市西乡塘区石埠卫生院检验科,南宁 530008;2.广西医科大学附属民族医院检验科,南宁 530001)
肺炎支原体(mycoplasmapneumonia,MP)感染主要引起支气管炎和非典型肺炎。有关MP感染机制还不是很明了。研究表明,MP感染刺激巨噬细胞、肥大细胞、平滑肌细胞和上皮细胞等细胞产生相关细胞因子和黏附分子刺激气道,使气道发生持续性炎症,加速气道重建[1~3]。细胞黏附分子(cell adhesion molecules CAMs)是一类能介导细胞与细胞、细胞与外基质相互黏附的糖蛋白,在炎症反应中,介导白细胞与内皮细胞的黏附及跨内膜转移[4]。有关细胞黏附分子在肺炎支原体肺炎的表达国内报道尚少。本研究通过小鼠感染模型检测血清和肺泡灌洗液(BALF)中黏附分子CD44和ICAM- 1的表达,并探讨CD44和ICAM- 1的表达与MP感染的相关性,为MP感染机制的研究提供理论基础。
1.1实验材料
1.1.1实验动物:BALB/c小鼠,SPF级,北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物许可证号:SCXK(京)2016- 009。BALB/c小鼠5周龄,20±2 g,雌雄各半。小鼠在广西中医药大学动物实验中心饲养。
1.1.2主要试剂:PPLO肉汤培养基,青岛海博生物技术有限公司提供;MP菌液,上海宝米科生物科技有限公司提供;替加环素,Wyeth Pharmaceuticals,Madison,NJ提供;CD44和ICAM- 1试剂盒购于美国R&D公司。
1.1.3仪器:酶标仪,上海科华生产,型号:MK3。
1.2实验方法
1.2.1MP的培养:MP在每瓶20 ml的SP4肉汤于37℃ 5%(v/v)CO2培养72 h后,肉汤变成橙色,倒出上清液,加新鲜的SP4肉汤2 ml到烧瓶,收集贴壁存活MP。将MP配成108~109CFU/ml,加制霉菌素(50 U/ml)和氨苄青霉素(1 mg/ml),样本保存在-80℃备用。
1.2.2动物模型的建立:实验方案由广西医科大学实验动物伦理委员会审查,所有的动物按照实验动物的护理和使用指南处理。新购的BALB/c小鼠在新环境下适应3天。将90只BALB/c小鼠随机分为对照组、模型组和替加环素治疗组,每组30只。对照组小鼠第1天、5天和8天皮下注射无菌生理盐水50 μl。模型组、替加环素治疗组小鼠第1天滴鼻接种含1×107CCU/ml MP菌液各50 μl;第5天、8天接种含1×107CCU/ml MP菌液各100 μl。替加环素治疗组小鼠于第9天起首次皮下注射替加环素10 mg/kg(0.2 g溶于5 g/ml葡萄糖注射液0.1 ml,即0.05 ml/g),以后每天按5 mg/kg连续6天皮下注射。模型组在相同时间注射等体积的生理盐水。用药期间观察各组小鼠的存活率、进食量、饮水量、活动量、精神状态、是否有竖毛、寒战、咳嗽,口、鼻分泌物数量是否增加等。在小鼠5,8,15,20和30天,各组分别取5只小鼠,用乙酰丙嗪氯胺酮按5 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠后用25号针头将500 μl SP4肉汤注入肺部,随后又将该液抽吸到注射器,BALF离心吸上清并储存在-80℃冰箱;小鼠眼眶取血,30 min后离心分离血清,血清储存在-80℃冰箱。肺标本用10 ml/dl福尔马林溶液固定进行组织学评价。
1.2.3指标检测
1.2.3.1MP小鼠情况观察:小鼠接种MP后,每天观察小鼠存活情况、进食量、饮水量、活动度、排便以及有无咳嗽等症状。
1.2.3.2肺组织HPS病理评分和肺实质评分:肺组织经10 ml/dl福尔马林固定,石蜡包埋切片,经苏木精- 伊红染色。肺组织病理学评分(HPS)由专业病理医师双盲镜检。HPS分级基于细支气管支气管浸润数目,细支气管支气管管腔渗出程度,血管周围浸润百分率和实质性肺炎严重程度(中性粒细胞肺泡浸润);该HPS系统分值从0~26,分数越高代表肺组织炎性浸润程度越高。实质性肺炎的得分是基于分级的中性粒细胞肺泡浸润(评分:0.没有实质性肺炎;3.片状实质性肺炎;5.片状融合实质性肺炎)。
1.2.3.3各组小鼠BALF中细胞因子的检测:采用ELISA法测定血清和BALF中CD44,ICAM- 1等黏附分子的水平,严格按照试剂盒说明书进行操作。
2.1小鼠接种情况 BALB/c小鼠接种MP后第1天,精神状态略差,活动减少,进食量和排便量减少,无咳嗽等呼吸道症状;第3~5天小鼠鼻腔出现少许分泌物并出现咳嗽;小鼠第8天出现乏力,精神状态较差,活动减少,进食减少,大便稍稀,鼻腔分泌物增多,出现咳嗽、竖毛、发冷等症状,说明造模成功。MP小鼠经替加环素治疗6天后,小鼠的精神状态逐渐好转,咳嗽寒颤等症状逐渐减少,进食和活动量逐渐增加。
2.2各组肺组织HE染色和肺组织病理评分PM感染小鼠5天,小鼠肺组织HPS评分和实质性肺炎评分明显升高,到8天达到高峰;用替加环素治疗肺炎支原体肺炎小鼠,小鼠肺组织HPS评分和实质性肺炎评分明显降低,与模型组比较差异有统计学意义(HPS评分P=0.035,实质性肺炎评分P=0.004;尤其是治疗6天后小鼠肺组织HPS评分和实质性肺炎评分降低非常明显与模型组比较差异有统计学意义(HPS评分P=0.002,实质性肺炎评分P=0.025)。
2.3各组小鼠血清和肺泡灌洗液中(BALF)黏附分子CD44和ICAM- 1表达水平见表1。BALB/c小鼠感染MP 5天、8天,其血清和BALF中CD44和ICAM- 1明显上升,与对照组比较差异有统计学意义(均P<0.000)。造模成功后,用替加环素治疗感染MP小鼠6天,MP小鼠血清和BALF中CD44和ICAM- 1表达与模型组比较明显下调,与模型组比较差异有统计学意义(均P<0.000),MP小鼠用替加环素治疗12天,其血清和BALF中CD44和ICAM- 1表达与模型组比较明显下调(均P<0.000)。MP小鼠用替加环素治疗21天,其血清和BALF中CD44和ICAM- 1表达与模型组比较明显下调差异有统计学意义(均P<0.000。
表1 各组小鼠血清和肺泡灌洗液中CD44和ICAM- 1表达水平(n=5)
肺炎支原体(MP)是非典型肺炎的病原体,儿童和青少年容易引起其他呼吸道感染如支气管炎、毛细支气管炎、喉炎等。病人咳嗽、发烧和头痛可能持续数周,恢复缓慢。据估计,在社区获得性肺炎中肺炎支原体肺炎约占30%。肺炎支原体肺炎四季发病并小规模流行,婴幼儿上呼吸道感染为主,青少年以支气管炎和肺炎为主,成年以肺炎多见。
肺炎支原体肺炎其发病机制尚不清楚,目前认为入侵的支原体经呼吸道上皮细胞黏附、局部宿主细胞损伤和过度的不适当的免疫反应似乎有助于肺炎支原体感染的发病机制。MP感染刺激巨噬细胞、肥大细胞、平滑肌细胞、上皮细胞等细胞产生相关细胞因子和黏附分子刺激气道,使气道发生持续性炎症,加速气道重建。MP对人类宿主呼吸道上皮的黏附是呼吸道上皮细胞定植和随后诱导疾病的先决条件[5,6]。
黏附分子(adhesion molecules,AM)是由细胞产生的并在细胞表面存在,能介导细胞和细胞、细胞和基质之间相互融合的一类分子。黏附分子在炎症性炎症和免疫调节过程中起重要作用:它可参与呼吸道炎症反应,作为病毒受体介导病毒感染,调节机体免疫反应和免疫调节。在肺炎发作时,肺毛细血管内皮细胞分泌的特异黏附分子促进气道黏膜炎症细胞的聚集;而细胞因子或炎症介质反馈作用启动这些粘附分子[7]。
黏附分子CD44是一种细胞表面跨膜糖蛋白分子的未分类的黏附分子,其基本功能是参与细胞和基质之间、细胞与细胞的特异性黏连过程。CD44分子参与细胞间的信号转导,参与肿瘤的生长、侵袭、转移,在炎症反应过程中CD44表达上调,与透明质酸(hyaluronan,HA)配体紧密结合[7]。哮喘急性发作使肺部血管内皮细胞分泌CD44增加并释放入血,促进嗜酸性粒细胞向气道趋化可增高气道反应性、促进淋巴细胞及其他炎症因子募集,加重支气管的痉挛程度及喘息症状[9]。
黏附分子- 1,又称细胞间黏附分子- 1(intercellular adhesion molecule,ICAM- 1),属于免疫球蛋白超家族。ICAM- 1是炎症反应过程中的极为重要组成部分:ICAM- 1与白细胞表面的巨噬细胞分化抗原- 1(macrophages differentiation antigen- 1,Mac- 1)和相应受体淋巴细胞功能相关抗原- 1(lymphocyte function associated antigen- 1,LFA- 1) 结合,介导炎症细胞渗出,参与炎症反应[10];ICAM- 1表达上调使炎症细胞在气道募集和黏附,触发炎症反应[11];此外,ICAM- 1还参与传递胞外- 胞内信号,使胞内蛋白磷酸化、诱导蛋白激酶和转录因子活化,从而产生大量的生物学活性。博莱霉素(bleomycin,BLM)上调大鼠肺纤维化模型血清中黏附分子ICAM- 1,与其配体结合促使嗜酸性粒细胞向气道内趋化,参与了肺泡炎症反应、气道高反应性及气道结构重建[12]。
本实验采用与人基因结构相似的BALB/c小鼠作为造模对象,BALB/c小鼠的遗传背景为近交系,亲近繁殖,遗传基因更纯,个体差异小,对MP敏感。本实验研究结果表明,在MP感染5~8天,小鼠血清和BALF中CD44,ICAM- 1水平明显升高(P<0.01),MP感染14天,小鼠血清和BALF中CD44,ICAM- 1水平升高到最高值(P<0.01),随着病情的发展,肺组织的持续纤维化,小鼠血清和BALF中CD44,ICAM- 1水平持续下降;用替加环素治疗MP感染小鼠后,小鼠血清和BALF中CD44,ICAM- 1水平明显下降,与模型组比较差异非常显著(P<0.01),肺组织病理检查可见肺部炎症减轻。表明MP感染小鼠后其血清和BALF中CD44,ICAM- 1水平与MP感染程度有关。其作用机制可能是当肺炎支原体感染时,入侵的支原体经呼吸道上皮细胞黏附,CD44调节细胞游走,可通过促进淋巴细胞在肺泡和肺间质内浸润,引起外周血淋巴细胞数量及功能异常、淋巴细胞亚群间比例失衡,并上调炎症因子IGF- 1,TNF- α,IL- 1β,IL- 8加剧炎症反应程度,嗜酸性粒细胞在气道过度聚集引起多种炎症介质表达上调,其中PAF水平增高可致细气管收缩。ICAM- 1机制可能与其配体融合促使嗜酸性粒细胞向气道内趋化、浸润并释放PAF,参与炎症反应。
综上所述,MP感染BALB/c小鼠后其血清和BALF中黏附分子CD44,ICAM- 1表达上调,CD44,ICAM- 1可能参与MP感染的病理生理过程,引起机体炎症。MP感染后CD44,ICAM- 1表达下调可能成为判断MP感染预后指标之一。
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