免疫比浊法测定尿液游离血红蛋白的方法学研究*

朱海波，尹　伶，王　新，严念道，邓建平

(1.黄石市爱康医院检验科，湖北黄石　435000；2.武汉科技大学医学院，武汉　430081)

人体血红蛋白正常分布于血液的红细胞内，红细胞代谢凋亡后血红蛋白呈游离状态释放入血液，故健康人群血浆中存在大约有50mg/L的游离血红蛋白，但尿液中游离血红蛋白含量极低。当血红蛋白量超过结合珠蛋白的结合能力时，血浆游离血红蛋白经肾小球滤出，当超1.00～1.35 g/L时，血红蛋白可随尿液排出，即可出现血红蛋白尿。此外，当某些病理情况下血管破损或通透性发生改变时，红细胞可经血管壁进入周围组织释放出血红蛋白，此时在相关标本中可检测到游离血红蛋白存在。医学实验室对微量的游离血红蛋白的检测亦称为隐血试验或潜血试验，是临床用于出血性或溶血性疾病鉴别诊断时最为常用的检查项目之一[1～21]，现有的方法学多为定性实验或半定量实验。目前实验室常用的检测方法主要有比色法、化学法和金标法，目前尿液潜血主要以化学法(干化学)为主。本实验室应用免疫透射比浊法原理设计了用于尿液游离血红蛋白的检测方法，旨在建立一种检测性能良好、并可实现自动化定量的方法应用于普通生化分析仪上，以解决现有方法学的不足。本研究内容经权威医学情报机构查新，国内外均未见报道。

1　材料与方法

1.1研究对象

1.1.1性能评价试验样本来源：在本实验室已完成检测的临床尿液标本中随机抽取干化学潜血试验为(±)和(2+)的新鲜标本各20份，将相同结果的样本离心取上清液等量混合，分别制备成低、高两种浓度的混合尿液标本S低，S高；另选取20份潜血试验为(-)并经胶体金方法确认的样本离心取上清液等量混合，作为空白样品。

1.1.2建立生物参考区间样本来源：在本院体检中心遴选常规体格检查健康、经尿液干化学测定潜血为阴性的受试者，剔除标准包括泌尿系统疾病或损伤、溶血性疾病、出血性疾病、高血压、高胆红素血症、女性受试者应避开月经期等，将可能影响参考值客观性的对象剔除，最终纳入本项测试的人数男性147例、女性162例；收集每位受试者新鲜尿液标本10 ml，以3 000 r/min离心5 min后取上清液用于生物参考区间的建立；在本院皮肤科、眼科的门诊患者中按上述剔除标准筛选男性、女性受检者各30例收集尿液标本，用于生物参考区间的验证。

1.2仪器和试剂

1.2.1仪器：东芝TBA- 120FR全自动生化分析仪、Beckman LH750全自动血细胞分析仪。

1.2.2试剂

1.2.2.1检测试剂原料：抗人血红蛋白单克隆抗体8 mg/ml，lot20151024(上海辽元生物)，聚苯乙烯羧基胶乳微球Estapor- 80nm(重庆中元)。

1.2.2.2检验试剂制备：

1.2.2.2.1试剂I：称取Tris 12.1 g加入800 ml ddH2O中充分混匀，调节pH至8.0；称取BSA 5 g溶于上述缓冲液中充分搅拌混匀；称取PEG8000 25 g溶于上述溶液中充分搅拌混匀；取PC300 1 ml加入上述液体中，加入ddH2O定容至1 L，加入0.1 mg/dl EDTA和防腐剂后密封贮存，备用。

1.2.2.2.2试剂II：将血红蛋白抗体进行4℃透析，透析液为50 mmol/L的PBS液；将80nm聚苯乙烯羧基胶乳微球用蒸馏水洗涤离心，重复3次；取上述处理的微球液1 ml，加50 mmol/L，pH5.8的MES buffer缓冲液，搅拌均匀；分别称取EDC，NHS 1 ml，加入其中搅拌均匀；加入血红蛋白抗体500 μl，搅拌反应过夜；称取BSA 50 mg加入反应，再取5 μl乙醇胺加入其中，终止反应；离心洗涤：20 000 r/min离心30 min，去除上清；重悬：取PBS buffer 10 ml，使沉淀悬浮；超声处理：将试剂采用细胞破碎仪进行超声处理，使胶乳颗粒分散均匀，加入0.1 mg/dl EDTA和防腐剂后密封贮存，备用。

1.2.2.3回收试验：人血红蛋白标准品H7379，1 g/支(北京北纳创联)。

1.2.2.4干扰试验：游离胆红素(FBil)(百灵威公司生产，批号L9BOL34)，结合胆红素(CBil)(百灵威公司生产，批号JHll- 5491)，维生素C(华瑞制药，批号SLBC7863V)，中/长链脂肪乳注射液(C6- C24，华瑞制药，批号80DH066)，动物血红蛋白(自制)。

1.3方法

1.3.1参数设置及定标：按TBA120生化分析仪操作程序进行参数设置；载入已制备的胶乳比浊法试剂；将人血红蛋白标准品H7379用ddH2O配制成1 000 mg/L，500 mg/L，250 mg/L，125 mg/L和0 mg/L的浓度系列进行定标；完成后观察标准曲线，包括对定标点偏离、定标曲线平滑程度、定标因子等；记录各校准点吸光度变化值，并用CORREL函数作相关性分析。

1.3.2回收试验：将1 000 mg/L的人血红蛋白标准液用空白样品稀释成浓度为100 mg/L和500 mg/L的两种标准液；将两种标准液分组加入S低，S高，按回收试验程序分别载入全自动生化仪进行游离血红蛋白检测，并计算不同样品浓度水平、不同加入物浓度下的回收率U。

1.3.3精密度试验：参照CLSI EP5- A2文件，以混合尿液标本S低，S高作为精密度试验样本，分装-20℃冷冻保存；定标后，每日分两个批次、每批次重复2次，分别检测尿液标本S低和S高，并记录结果；按下述方法计算S低和S高两个浓度水平下的室内精密度CV：

其中I=总的运行天数(有两个批次)；Xi1=第i日第1批运行结果的均值；Xi2=第i日第2批运行结果的均值；该公式不适用于某一日仅有一个批次的数据的计算。

其中：I=总的运行天数；Xi=第i日所有结果的均值；X=所有结果的均值。

其中：Srr=批间标准差的评价

通过该公式将会获得与通过所有观测值所计算的标准差不同的ST。上面的公式是评价仪器精密度的正确方法，因为它恰当的平衡了重复性以及日间和批间的成分。精密度评价的变异系数CV为检测物的浓度除ST再乘以100，结果以百分比表示。

1.3.5线性试验：参照CLSI EP6- A文件，将人血红蛋白标准品H7379用空白样品配制成浓度为1 000 mg/L的溶液，按表1稀释方案配制成系列浓度梯度；如果浓度1 000 mg/L的样本仍在线性范围内，需制备更高浓度的溶血样本重新寻找线性的cut值；如果10%稀释浓度以上的样本均不在线性范围内，需制备更高稀释倍的梯度样本重新寻找线性cut值；将稀释后的系列浓度的样本依次上机检测，每个样本重复检测2次获得均值；将线性试验偏差的目标设定为预期值的±5%，将每个样本的检测结果按下式进行计算得到点偏差T，如果>5%则判断为超出线性范围：T=(Xn-Yn)/Yn，其中：Xn表示梯度样本中第n个点的测定值；Yn表示梯度样本中第n个点的预期值。

表1 线性试验样本稀释程序

1.3.6干扰试验：参照CLSI EP7- A2文件，分别使用S低和S高作为基础样本，用基础样本以1∶20比例分别稀释 5种干扰物贮存液、空白样品作测试和对照样本，稀释后测试样本中游离胆红素、结合胆红素、维生素C、乳糜浓度、动物血红蛋白分别是342 μmol/L，342 μmol/L，0.03 g/L，1 450 FTU，500 mg/L；计算最大允许干扰值(dmax)/批内标准差(s)比值，查dmax/s与重测次数对应表，得出2个浓度水平重复测定次数，其中s由基础样本重复测定10次计算而得，dmax为各项目临床意义差别标准，本研究设定尿液游离血红蛋白的dmax为基础样本均值的10%；对测定数据进行干扰效应的点估计，即测试样本与对照样本的测定均值之差(dobs)与临界值(dc)进行比较，若点估计dobs>dc则说明存在干扰；对于存在干扰的项目，对干扰物贮存液分别以10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%比例稀释后再重新进行干扰实验，以确定该方法抗干扰的最大浓度值。

1.3.7建立生物参考区间并验证

1.3.7.1建立生物参考区间：定标后检测男、女两组受试者尿液样本中游离血红蛋白浓度并记录结果；对两组结果进行正态分布Shapiro- Wilk检验(W检验)，如果资料呈偏态分布，采用第99百分位值作为参考值上限；如果资料呈正态分布则取95%置信区间作为参考值范围。两组间参考值差异性比较采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

1.3.7.2生物参考区间验证：对验证样本进行尿液游离血红蛋白检测，计算处于参考区间内的样本百分比。

1.4统计学分析分别按照性能评价试验要求，应用SPSS19.0软件进行统计分析。

2　结果

2.1参数设置及定标曲线

2.1.1项目参数：本方法在东芝TBA120全自动生化分析仪上的参数设置见表2。

2.1.2定标曲线：定标为通过状态；定标曲线符合平滑的抛物线形态，经logit- log线性回归成直线后，吸光度值(Y)与定标液浓度(X)的回归方程为Y=3 527X+8.897；定标液浓度与吸光度值经相关性分析，r=0.980 7>0.975，r2=0.961 8>0.95，呈高度相关。

表2 胶乳增强免疫比浊法测定尿液游离血红蛋白在TBA120上的参数设置

2.2方法学性能评价

2.2.1回收试验：S低加入浓度为100mg/L和500mg/L的回收率分别为95.3%和102.7%；S高加入浓度为100 mg/L和500 mg/L的回收率分别为104.2%和103.5%，两组样本加入不同浓度标准液后的回收率U均介于95%～105%区间内。

2.2.2精密度试验：低值样本S低和高值样本S高的总不精密度CV分别的6.52%和4.18%。

2.2.3灵敏度试验：本方法检测的分析灵敏度为2.8 mg/L。

2.2.4线性试验：本方法检测的线性范围为0～1 100.0 mg/L。

2.2.5干扰试验：当样本中游离胆红素、结合胆红素、维生素C、动物血红蛋白分别小于342 μmol/L，342 μmol/L，0.03 g/L，500 mg/L时对本试验结果无干扰；当乳糜浓度>870 FTU时对本试验结果有显著干扰；其抗干扰性能接近本实验室临床化学常规项目水平。

2.3生物参考区间及验证

2.3.1纳入的研究对象经剔除标准筛选后，用于参考值统计的男性样本数为147例、女性样本数为162例；W检验P<0.05，呈均偏态分布；采用第99百分位值作为生物参考区间上限，男性生物参考区间为0～13.3 mg/L、女性生物参考区间为0～17.1 mg/L；男性与女性的参考范围经t检验，t=1.129，P>0.05，无显著性差异。

2.3.2两组验证样本的检测结果均落在本次建立的生物参考区间范围内。

3　讨论

医学实验室对血红蛋白的检测最初是源于全血标本，方法学大致分为4类，即全血铁法、比密法、血气分析法和比色法，其中以比色法最为常用，是利用血红蛋白衍生物的光谱特征进行测定。血红蛋白在正常尿液标本中含量极低，病理状态下尿液中虽可出现大量血红蛋白，但其绝对值仍较低，采用常规的测定方法其灵敏度远不能满足尿液标本的性能要求。多年来，国内外学者对尿液游离血红蛋白测定的方法学进行了众多研究，主要有试带法(干化学法)、比色法和免疫法三类，方法学性能各有差异[22]。

为了解决尿液游离血红蛋白检测的灵敏度、特异度、数值化检测等问题，本课题组设计了基于免疫法原理的胶乳增强免疫比浊法。该方法选择的抗HBA0抗体是人类血红蛋白中最主要、最稳定的组分[23～25]，保证了方法学的特异性。本方法的参数设置参考了临床化学检验中的同类型项目，如尿液MAlb、尿液β2- M等，并在此基础上进行了调整，以保证方法学达到预期的性能。研究结果显示定标曲线呈良好的抛物线形态、各测定点较定标曲线无明显偏离、被测物浓度与测试响应程度(吸光度值)之间呈高度相关，该项数据是证实方法学是否成立的最关键依据。在进行正确度评价方面值得注意的是，胶体金法虽然可作为潜血试验的确证方法[22]，但目前仅限于定性试验；试带法和比色法虽然灵敏度较高，但特异度较差，且均为定性或半定量试验；虽然国内外有报道使用散射比浊法专用仪器进行隐血定量检测[26～30]，但该仪器仅限于粪便标本的检测，其方法学性能是否适用于尿液或其他类型标本检测尚未明确，因此现有的方法学均不宜作为参考系统对本方法学进行准确度的评价。本研究中选择了以回收试验作为正确度评价试验，通过对加入标准品的测定结果与预期值的符合性进行判断，客观反映本方法学的准确度。本研究中方法学性能评价分别参照CLSI(美国临床实验室标准化协会批准指南)的EP5- A2，EP17- A，EP6- A，EP7- A2等指南性文件进行试验，性能评价试验结果表明该方法检测性能接近本实验室临床化学常规项目的水平，具备检测临床尿液标本的能力。

此外，游离血红蛋白检测在临床其他类型标本中亦应用极为广泛，包括粪便、胃液、血浆、浆膜腔积液、脑积液、唾液等，其中部分标本尚未找到理想的方法学，因此本研究的数据为胶乳增强免疫比浊法检测游离血红蛋白在其他类型标本中的应用提供了新的思路和参考依据。

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