程 涛,黄 刚
(1.泾阳县医院检验科,陕西泾阳 713700;2.陕西中医药大学附属医院检验科,陕西咸阳 712000)
动脉粥样硬化(AS)导致的冠脉管腔狭窄或闭塞是引起冠心病患者心肌缺血缺氧或坏死的主要原因,冠状动脉介入术(PCI)已成为冠心病治疗的重要手段之一,但PCI术后仍有20%的患者出现支架内再狭窄(ISR)或血栓形成等不良缺血性事件[1]。微小RNA(MicroRNAs,miRNAs)通过调控基因表达,来参与机体各种疾病的发生发展过程。有报道认为,miRNAs能够调控多种心脏疾病的病理过程,其在缺血性心脏病的病理过程中呈现差异性表达[2]。研究发现miRNAs可稳定存在与血液循环中,并且可能作为诊断疾病的生物学标志物[3]。笔者通过检测100例接受PCI术的急性冠脉综合征(ACS)患者的血清miRNA- 21,miRNA- 126的表达水平,旨在探讨其对于缺血缺氧条件下心肌细胞凋亡水平的调节,及对心肌梗死后心功能及心肌细胞凋亡水平的影响,并为PCI术后ISR的早期发现提供依据。
1.1研究对象选取2015年7月~2017年7月我们医院心血管内科住院接受PCI治疗的ACS患者82例为研究对象,按术后是否出现ISR分为两组:狭窄组30例,未狭窄组52例,其中男性51例,女性31例,平均年龄52.3±12.2岁。ACS的诊断依据世界卫生组织关于ACS及急性心肌梗死(AMI)、不稳定型心绞痛的诊断标准,同时补充2007年全球心肌梗死工作组关于ACS及AMI的修正定义[4]。ACS患者中AMI 43例,UA 39例。对照组选取冠状动脉造影阴性的患者,男27例,女22例,平均年龄55.3±13.7岁。所有患者病变位于前降支者53例,病变位于右冠脉者23例;位于回旋支者6例。PCI术后ISR诊断标准:经冠脉造影显示患者原病变部位支架内和节段内血管管腔直径狭窄≥50%。选取同期在本院体检中心体检健康者33例作为对照组,其中男性20例,女性13例,平均年龄51.9±12.9岁。两病例组患者均于支架置入术后服用阿司匹林100 mg/d 及波力维 75 mg/d。所有试验对象排除瓣膜性心脏病、扩张型心肌病、肥厚型心肌病、心肌炎、肿瘤、肌肉疾病、肝肾功能不全及感染性疾病。各组患者性别、年龄比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。本研究经本院伦理委员会批准,所有研究对象签署知情同意书。
1.2试剂和仪器RNA提取采用mirVANA PARIS试剂盒。PCR试剂盒采用上海起福生物科技有限公司产品。lightCycler荧光PCR仪采用德国Roche公司产品。血管内超声检查采用Boston Scientific Clearview血管内超声仪。介入系统为德国SIEMENSCOROSKOP TOP心血管造影系统。
1.3方法
1.3.2标本采集:PCI患者于术后6个月行IVUS检查的当天采集静脉血5 ml,对照组研究对象于体检时采集静脉血5 ml。所有研究对象采集的血液于2 h内分离血清,4℃,3 000 r/min离心10 min,取上清液4℃,3 000 r/min离心10 min,将所得的血清标本分装于无RNA酶的冻存管中,-80℃保存备用。
1.3.3miRNAs表达量检测:采用实时逆转录- 聚合酶链反应技术研究甲亢患者血清miRNA- 21,miRNA- 126表达水平。
1.3.4RNA的提取及保存:首先吸取200 μl血液样品、750 μl的RNA提取试剂和 20 μl冰醋酸,常温下孵育5 min。再加入 0.2 ml氯仿,常温下孵育3 min。然后离心取上清倒在无RNA酶的Eppondorf管中,加入等量异丙醇,常温放置10 min。再离心,弃上清,室温干燥。再通过RNA溶解步骤,获得RNA溶液-20℃保存。
1.3.5PCR扩增:用pfimer5软件设计引物。miRNA- 21的引物序列为:正义链5’- GATGATGCGCGAGAAGGAGGAGTT- 3’,反义链 5’- GGGGCGGGGGTGCTGTCAT- 3’;产物长度590 bp。miRNA- 126的引物序列为:正义链5’- GGGGTCGTACCGTGAGT- 3’,反义链 5’- CAGT GCGTGTCGTGGAGT- 3’,产物长度620 bp。U6作为内参照,引物序列为:正义链5’- GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT- 3’,反义链5’- CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT- 3’,产物长度320 bp,反应条件:94℃3min→94℃60 s,58℃60 s,72℃1.5 min,40个循环→72℃15min→4℃保存。
1.3.6标志物相对表达量计算:对扩增的目的片断进行凝胶电泳,通过紫外光凝胶成像系统进行扫描并记录,测定各组的cDNA的特异性,miRNA表达量用Ct值变化表示。△Ct=Ct(目的基因)-Ct(内参基因)。由2-△Ct得出相应的miRNA相对表达量。
(3)BP人工神经网络能够对MDEA溶液吸收能力进行较准确的预测,其平均相对误差与最大相对误差普遍较小,说明预测值与真实值比较接近,完全满足误差小于10%的相关要求。
2.1各组IVUS结果比较见表1。狭窄组的PLA与未狭窄组比较显著增高,而MLA显著降低,其差异均有统计学意义(P=0.000)。
项 目未狭窄组(n=52)狭窄组(n=30)tPPLAMLA626±183596±2101097±236356±192113959300000000
注:PLA:斑块面积;MLA:最小管腔面积。
2.2各组血清miRNA- 21,miRNA- 126水平比较见表2。与对照组比较,血清miRNA- 21在狭窄组与未狭窄组的表达量明显增高,而miRNA- 126水平则显著降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。狭窄组与未狭窄组比较miRNA- 21水平明显增高,而miRNA- 126水平则显著降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。
表2 PCI患者术后血清miRNA- 21,miRNA- 126水平比较
注:miRNA- 21:微小RNA- 21;miRNA- 126:微小RNA- 126;*与对照组比较P=0.000;#与未狭窄组比较P=0.000。
2.3相关性分析见图1~5。狭窄组中miRNA- 126与miRNA- 21水平呈负相关性(r=-0.919,P<0.01)。该组中miRNA- 126和miRNA- 21水平分别与PLA和MLA具有相关性(r=-0.945,0.926,P<0.01),(r=0.933,-0.917,P<0.01)。
图1 miRNA- 126与miRNA- 21相关性散点图 图2 miRNA- 126与MLA相关性散点图
图3 miRNA- 21与MLA相关性散点图 图4 miRNA- 21与PLA相关性散点图
研究表明支架介入术容易引起血管内皮细胞的损伤。这种损伤引起机体的自我修复,而修复过度则可能引起血管再狭窄。PCI治疗过程中导致动脉血管壁的直接损伤,可能引起炎症反应的发生、血栓形成以及血管内膜过度增殖等。血管壁的这些变化最终引起血管新生内膜形成及血管重塑,导致PCI术后再狭窄的发生[5]。miRNA在癌症等疾病中已得到广泛应用,在冠心病领域也一直成为人们关注的焦点。miRNA- 21被证实通过影响心肌细胞的凋亡来参与心脏疾病的进展,其表达水平在心肌梗死患者的心脏组织中呈现显著上调[6]。miRNA- 21的表达在正常心肌组织中表达很低,但在各种心衰、心肌肥厚、缺血缺氧等条件下表达水平明显增高。研究认为心绞痛患者外周循环miRNA- 21表达较对照组上调1.9倍,而AMI患者则上调3.2倍[7]。Zhang等[8]对412例下肢动脉闭塞性疾病患者的研究显示在介入治疗术后再狭窄组外周循环miRNA- 21水平显著增高,在术后无狭窄组则明显降低。研究分析70例PCI术后的冠心病患者的结果显示冠脉支架术后狭窄组患者血清 miRNA- 21水平明显增高[5]。以上研究提示miRNA- 21水平在血管出现狭窄或闭塞时呈现过量表达。本研究结果显示冠脉支架术后狭窄组miRNA- 21水平高于未狭窄组(P<0.01),推测PCI术后的冠状动脉损伤引起血管内膜过度增殖可能与PCI术后冠脉狭窄的发生有密切的关系。进一步的研究显示未狭窄组患者血清miRNA- 21水平显著高于对照组(P<0.01),提示PCI术后患者可能存在再狭窄的风险。miRNA- 21在缺血性心脏病的研究尚处于起步阶段,随着对miRNA- 2l研究的不断深入,相信miRNA- 21对于缺血性心脏病及ISR发生的防治值得期待。
图5 miRNA- 126与PLA相关性散点图
既往的研究表明动脉粥样硬化可能导致冠脉管腔的狭窄或闭塞,其可能与PCI术后再狭窄的病理过程有关[1]。miRNA- 126在血管内皮细胞中的特异性表达已被证实,其表达的下调可提高细胞黏附分子- 1活性,促进新生血管的形成,维持血管壁的完整性[9]。另外,miRNA- 126调控血管黏附细胞因子- 1的表达,影响着动脉粥样硬化斑块形成的发展过程。研究显示静脉注射miRNA- 126可以抑制小鼠主动脉粥样硬化病变,其结果使主动脉粥状硬化斑块的面积减小,表明miRNA- 126与动脉粥样硬化斑块的形成有密切关系[10]。推测miRNA- 126在血管炎症及动脉粥样硬化的发展中起着重要的保护作用。Wang等[11]采用RT- PCR技术研究miRNA- 126,瑞舒伐他汀以及血管内皮生长因子三者间的关系。他们的实验结果显示心肌梗死小鼠模型中miRNA- 126的表达显著减少,但血管内皮生长因子表达水平增加。miRNA- 126在PCI术患者外周血液的表达也有报道。PCI术后心肌梗死患者通过增强型体外反搏疗法后循环miRNA- 126水平较未采用该疗法的患者显著增高[12],证明增强型体外反搏疗法治疗心肌梗死患者的有效性,另一方面也印证了miRNA- 126在心肌缺血缺氧中的保护性作用。本实验结果显示狭窄组患者血清miRNA- 126表达显著低于未狭窄组和对照组患者(P<0.01),未狭窄组与对照组比较,血清miRNA- 126表达明显降低(P<0.01)。提示冠脉造影阳性患者经过PCI术后冠状动脉的缺血得到缓解,发生心肌梗死的风险明显降低。因此认为检测血清miRNA- 126表达可用于ACS疾病的早期诊断,并可能成为预测AMI疾病发生的分子标记物。
本研究相关性分析的结果显示,狭窄组中miRNA- 21和miRNA- 126表达呈负相关性。该组中miRNA- 126和miRNA- 21水平分别与PLA 和MLA具有相关性。提示两个标志物与PCI术后的ISR发生密切相关。其变化可以反映PCI术后患者症状的改善状况。
综上所述,血清miRNA- 21和miRNA- 126的检测可应用于PCI术后ISR的预测,并可能为其提供有效的基因学依据。
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