一例耐药严重的大肠杆菌和轮状病毒混合感染案例

殷鑫欢，杨晓宇，徐 雷，王佳煜，李原野，徐志文，2，朱 玲，2

（1.四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130；2.四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川 成都 611130）

猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PoRV）、猪传染性胃肠炎病毒（Porcine transmissible gastroenteritis,TGEV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea,PEDV）是引起仔猪腹泻的主要3种病毒。其中猪轮状病毒属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）轮状病毒属（Rota-virus），猪的轮状病毒多发于每年的12月至翌年的1、2月份，夏季也有该病暴发的报道。并且各种年龄、性别的猪都可以感染轮状病毒，尤其以仔猪感染最为严重，1周龄以内的仔猪在无母源抗体的保护下感染，随着年龄的增长，猪感染轮状病毒的症状有所减轻。研究报道，猪轮状病毒常和大肠杆菌、沙门氏菌等混合感染，且与猪流行性腹泻病毒混合感染引起的肠道损伤比单一感染造成的损伤更为严重。PoRV存在多种血清型，各血清型之间无交叉保护或交叉保护性很差。资料显示，我国猪群中轮状病毒的感染以A群为主，在A群中VP7是中和抗原基因，它编码轮状病毒外壳上主要糖蛋白和中和抗原蛋白，在各毒株中高度保守。

猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的猪的一种急性传染病，主要表现为肠炎、肠败毒血症等多种临床症状，世界各地均有发生，造成新生仔猪大批死亡或生长不良。猪大肠杆菌由于猪的生长期和引起发病的血清型的差异，可将疾病分为仔猪黄痢、仔猪白痢和仔猪水肿。传播途径主要是母猪粪便中排出的致病性大肠杆菌，污染母猪的皮肤与周围环境，仔猪通过吃乳和舔吮母猪的皮肤而感染。但是疾病的发生与周围环境、卫生条件以及哺乳母猪的体质存在着密切的关系。由于畜牧兽医上常使用抗生素作为促生长剂以提高生产效益，并且我国在兽用药物的生产管理上还不规范，抗生素的使用很不规范，很多头孢三四代药物直接就使用，而没有使用有效果的头孢一二代，一些平时比较简单的临床症状直接就使用抗生素，导致发病时抗生素的使用效果较差。

1 发病情况、临床症状和剖解症状

2017年，四川省绵阳市某猪场的产房小猪普遍发生黄色水样腹泻，外观表现为小猪被毛凌乱，耳部发绀，消瘦，通过解剖发现肺脏、肝脏没有什么特殊症状，主要就是肠道积满了黄色的水样物，结合临床症状，诊断为PoRV和大肠杆菌混合感染。通过对从肝脏和小肠腹泻物中分离的大肠杆菌进行实验室的药敏试验发现，该大肠杆菌耐药严重，20多种检测的药物之中，百分之九十都耐药，耐药情况比较严重。

2 实验室检测

2.1 试验地点

病料（2头腹泻仔猪，分别用编号1和2来代替）送至四川农业大学动物生物技术中心进行检测。

2.2 试验试剂

DNA、RNA提取试剂盒，Taq DNA聚合酶，RNA反转录试剂盒，均购自TaKaRa公司，引物均由上海Sangon生物工程公司合成。

2.3 试验器材

美国Thermo Micro21R微量离心机购自赛默飞成都分公司；PCR仪购自成都伯乐科技有限公司。

2.4 检测方法

（1）取样小肠腹泻段研磨提取病料中的RNA和DNA，采用反转录-聚合酶链式反应RT-PCR检测 PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV（猪德尔塔冠状病毒），聚合酶链式反应PCR方法检测PRV（猪伪狂犬病病毒）、PCV2（圆环病毒2型）。试验方法均按照试剂盒说明书操作，所用引物如下。

根据GenBank已发表的上述病毒的序列，采用本实验室的检测通用引物，均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）进行RT-PCR和PCR检测。

表1 PCR引物序列

（2）采取病猪的肝脏和小肠黄色腹泻物分别划线麦康凯培养基，置于细菌培养箱37℃培养，12 h后均长出了红色的菌落，即为大肠杆菌，染色观察为单个存在的革兰氏阴性杆菌，挑取单个菌落接种LB肉汤置于细菌摇床37℃、180 r/min培养12 h。0.2 mL/只腹腔注射小白鼠，结果小鼠同样表现出腹泻，黏附垫料并且于24 h内死亡，解剖之后肝脏同样能够分离到大肠杆菌。

3 结果与防治措施

（1）通过对几种能够引起腹泻的病毒检测，这次病例中只有PoRV检测为阳性，条带大小为308 bp，图1中检测的两头猪中1号为PoRV阳性，2号没有检测出PoRV，图1中分别设置阴阳性对照，证明本试验是成立的。

图1 两份病猪样品PoRV电泳结果

（2）大肠杆菌的药敏结果见表2，参照标准为药品试验纸片抑制法，由杭州天河微生物试剂有限公司采用美国NCCLS最新药敏试验法规制备的标准厚纸片，纸片直径（6.0±0.05）mm，纸片含药量符合标准。

表2 大肠杆菌药敏结果

（3）针对检测结果，采取防治措施：①免疫接种。对仔猪使用猪传染性胃肠炎、轮状病毒弱毒疫苗（哈尔滨兽医研究所研制）进行免疫预防，新生仔猪可在吮乳前肌注传染性胃肠炎、轮状病毒二联弱毒疫苗1 mL，至少经过30 min才能再吮乳，并在断奶前7～10 d肌内注射2 mL，才能够持续保护6个月，妊娠母猪可分别在分娩前5～6周和1周肌内注射1 mL。②要加强饲养管理，猪场严格采取全进全出制，从确保没有感染疾病的地方引进猪群，猪圈要经常清扫，且饲养不同批次的猪圈必须经过全面彻底的消毒处理。③猪场应该合理使用抗生素，并且避免直接使用规格较高的像头孢三四代药物，也不能频繁使用抗生素，至于在饲料里面添加的预防类的抗生素可以隔一段时间换一下，避免菌株产生耐药性以致于后面使用抗生素没有什么作用，像这次分离的大肠杆菌就是耐药性特别严重，上述的药物对它都没有什么效果或者完全耐药，因此在临床中一定要合理使用抗生素。此外，仔猪在断奶阶段可以服用一些微生态制剂调节仔猪肠道菌群平衡，以抑制致病性大肠杆菌的增殖。

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