氯化钾溶液对大鼠脑组织缺血再灌注损伤的影响及机制

方卫，李诺，覃斯娜，覃涛，杨叶桂，陈蒙华

(广西医科大学附属第二医院，南宁530000)

脑缺血持续一段时间后恢复血供，脑细胞可能因为缺血再灌注而遭受更严重的损伤，其机制与细胞凋亡的诱发有关[1]。有研究表明，细胞凋亡与细胞内K+浓度具有密切关系。体外实验发现，在细胞凋亡初期即可观察到K+外流，而提高细胞培养液的K+浓度能够减轻、逆转细胞凋亡[2]。Ca2+作为细胞的第二信使参与脑内的多种代谢活动，发生缺血再灌注损伤时，细胞内的Ca2+急剧上升，超过Ca2+的调控范围，造成Ca2+超载以及一系列的级联反应；也有研究[3]表明，使用钙通道阻滞剂可以减轻细胞凋亡。因此我们推测，提高细胞外K+浓度可能部分通过拮抗Ca2+超载产生了保护作用。为验证此假说，2017年3～7月，我们借助大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，在大鼠脑组织恢复灌注时给予氯化钾(KCl)溶液调整血K+浓度，观察局部脑组织损伤情况，并对Ca2+超载相关指标进行检测。

1　材料与方法

1.1　动物与试剂

SPF级健康雄性SD大鼠36只，体质量220～280 g，由广西医科大学实验动物中心提供。大鼠术前禁食12 h，自由饮水。钙ATP酶(Ca2+-ATPase)、乳酸脱氢酶(LDH)、钙调神经磷酸酶(CaN)、Ca2+检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，钙调蛋白(CAM)检测试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司。

1.2　动物分组

将大鼠随机分成模型1组、模型2组和假手术组各12只。

1.3　模型制备与干预

模型1组和模型2组腹腔注射10%水合氯醛麻醉，从大鼠胸锁乳突肌和颈前肌群之间向深部分离，显露右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉。使用动脉夹夹住颈总动脉近心端，缝线结扎颈外动脉远心端。在颈外动脉距离颈总动脉分叉约5 mm处剪口，用线栓由剪口处经颈外动脉进入颈内动脉，剪断颈外动脉并游离，调整方向避开翼腭动脉的开口处到达大脑中动脉。当线栓进入长度距颈总动脉分叉处15 mm时，缓慢插入线栓，使线栓头部刚好完全阻闭右侧大脑中动脉入口。阻闭120 min后，拔出线栓并移除颈总动脉的血管夹，使缺血部位恢复灌注；同时模型1组由右侧颈外静脉泵入2.8%KCl溶液90 μg/g，模型2组由右侧颈外静脉泵入生理盐水90 μg/g。假手术组只分离和结扎右侧颈外动脉，不使用线栓阻断大脑中动脉。恢复灌注后监测大鼠生命体征1 h，随后缝合伤口，将大鼠放回笼内单独喂养。

1.4　神经功能评价

再灌注24 h后，各组随机抽取6只大鼠，依照文献[4]对大鼠进行神经功能评分。评分标准：0分为正常，无神经损伤症状；1分为不能完全伸展对侧前爪；2分为向外侧转圈；3分为向对侧倾倒；4分为不能自发行走，意识丧失。

1.5　脑组织病理检查

采用HE染色法。再灌注24 h后，各组随机取6只大鼠。用10%水合氯醛麻醉，断头取脑；4%多聚甲醛灌注固定，石蜡包埋，常规脱蜡水化，梯度乙醇浸洗。苏木精染色，自来水冲洗；盐酸乙醇分化，自来水冲洗；伊红染色，自来水冲洗；逆乙醇梯度脱水，二甲苯再次透明，封片。光学显微镜下观察脑组织病理学变化，并拍照记录。

1.6　脑组织上清液Ca2+超载相关指标检测

采用比色法。再灌注24 h后，各组取剩余6只大鼠，麻醉，断头，取右侧脑皮质部分制成匀浆，离心取上清液。Ca2+-ATPase、LDH、CaN活性检测以及Ca2+水平测定采用化学比色法，CAM检测采用ELISA法。

1.7　统计学方法

2　结果

2.1　三组神经功能评分比较

模型1组、模型2组、假手术组的神经功能评分分别为(2.17±0.75)、(3.50±0.55)、(0.83±0.41)分。与假手术组比较，模型2组的神经功能评分高(P<0.05)；与模型2组比较，模型1组的神经功能评分低(P<0.05)。

2.2　三组脑组织病理结果比较

与假手术组比较，模型2组低倍镜下可见明显的低密度区，且集中于右侧皮质部分，此低密度区域正常细胞数量极少；高倍镜下可见多数细胞发生变性，坏死，可见染色质的边集、核固缩，空泡细胞也较多见。与模型2组比较，模型1组低倍镜下可见右侧皮质部分低密度区面积明显减少，正常细胞数量较模型2组增多；高倍镜下染色质的边集，核固缩较模型2组少，坏死细胞、空泡状细胞也明显较模型2组减少。

2.3　三组脑组织上清液中Ca2+-ATPase、LDH、CaN活性以及Ca2+、CAM水平比较

与假手术组比较，模型2组的Ca2+-ATPase活性降低，LDH、CAN活性增高，Ca2+和CAM水平增加(P均<0.05)；与模型2组比较，模型1组的Ca2+-ATPase活性增高，而LDH、CaN活性降低，Ca2+和CAM水平降低(P均<0.05)。见表1。

表1　三组脑组织上清液中Ca2+-ATPase、LDH、CaN活性以及Ca2+、CAM水平比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型2组比较，#P<0.05。

3　讨论

脑缺血再灌注损伤具有复杂的病理生理过程，其发病机制涉及能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸毒性、细胞内Ca2+超载、自由基损伤、炎症反应等多个环节。脑缺血再灌注时脑细胞膜受到多种因子的影响，引起一系列的分子生物学反应，使胞核浓缩，核碎裂，核溶解，细胞发生变性、坏死等表现，而且脑内细胞成片的坏死和凋亡，直接影响到神经功能表现。体外研究[2]表明，细胞内的K+对细胞凋亡具有重要作用，提高细胞培养液中的K+浓度能够减轻甚至逆转细胞凋亡。本研究通过对动物MCAO模型恢复再灌注的同时给予KCl溶液，观察提高血清K+浓度能否对脑组织发挥保护作用，探讨K+对大鼠脑组织缺血再灌注损伤的影响。结果显示，模型1组的神经功能评分低于模型2组，HE染色凋亡细胞较模型2组减少。表明缺血再灌注时提高血K+浓度对脑细胞有一定的保护作用。

Ca2+是神经细胞信息传递的重要的第二信使，参与细胞内外的各种生物电活动和信息传递，维持生物的代谢功能[5]。细胞内Ca2+超载是脑缺血再灌注损伤机制的共同通路，引起神经元死亡的最后途径[6]。Ca2+-ATPase是细胞内调节Ca2+稳态的重要酶之一，可以把Ca2+转移至胞质以外，使得胞质内Ca2+浓度维持在较低水平[7]。当Ca2+-ATPase的活性下降时，不能及时将胞质内多余的Ca2+排出细胞外，而胞质高浓度Ca2+状态还会使得细胞内的Ca2+库释放Ca2+，从而引发Ca2+超载，最终诱发一系列的级联反应导致细胞凋亡[8～10]。Ranasinghe等[11]研究显示，使用含K+溶液可提高Ca2+-ATPase mRNA的表达，并且提高Ca2+-ATPase mRNA的表达可以改变与心肌收缩和舒张相关的蛋白质，改善心肌收缩压和舒张压，从而对机体产生有益的血流动力学影响。本研究结果显示，脑缺血再灌注损伤后，脑组织中Ca2+-ATPase活性下降，细胞内Ca2+增加，提示细胞内发生了Ca2+超载；而使用KCl调整血K+浓度后，细胞内的Ca2+-ATPase活性上升，胞质内Ca2+浓度降低。这表明提高再灌注液的血K+浓度可减轻大鼠脑缺血再灌注损伤，其机制可能与拮抗Ca2+超载有关。

CAM是目前发现的生物体内最重要的Ca2+蛋白受体，是Ca2+的细胞内靶点，CAM的激活需要Ca2+的结合。CAM与Ca2+结合后，通过调节与激酶、磷酸酶等靶蛋白的相互作用，成为Ca2+信号转导通路的一部分[12]。而CaN是一种受Ca/CAM调节的蛋白酶，与脑内多种神经递质有关，例如多巴胺、谷氨酸等[13]。有研究[14～16]表明，CaN升高与阿尔茨海默病、精神分裂等脑功能损害的疾病有关。本研究结果显示，大鼠大脑发生缺血再灌注损伤后，CAM和CaN分别伴随着胞质内Ca2+浓度升高而升高，提示出现了与Ca2+超载特异性相关的损伤。而灌注时接受KCl干预的大鼠，在24 h后CAM、CaN均明显下降，表现出调整血K+拮抗Ca2+超载的脑保护作用。另一方面，LDH在脑细胞中广泛存在，可以调节机体的自动代偿性保护机制。脑缺血再灌注损伤发生时，脑组织损伤，释放LDH，使脑细胞内的LDH活性增高。本研究结果显示，模型1组的24 h LDH水平降低，表明脑损伤程度减轻。

综上所述，脑组织缺血再灌注损伤后升高血K+浓度，能够一定程度地减轻脑缺血再灌注损伤，为临床采用调整血K+水平治疗脑损伤提供了实验依据。

参考文献：

[1] Ann Panetta J, Clemens JA. Novel antioxidant therapy for cerebral ischemia-reperfusion injury[J]. Ann N Y Acad Sci, 1994,723(1):239-245.

[2] Yu SP, Yeh CH, Sensi SL, et al. Mediation of neuronal apoptosis by enhancement of outward potassium current[J]. Science, 1997,278(5335):114-117.

[3] Jia Z, Chen Q, Qin H. Ischemia-induced apoptosis of intestinal epithelial cells correlates with altered integrin distribution and disassembly of F-actin triggered by calcium overload[J]. J Biomed Biotechnol, 2012,2012:539-617.

[4] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1):84-91.

[5] Bagur R, Hajnoczky G. Intracellular Ca2+sensing: its role in calcium homeostasis and signaling[J]. Mol Cell, 2017,66(6):780-788.

[6] Vannucci RC, Brucklacher RM, Vannucci SJ. Intracellular calcium accumulation during the evolution of hypoxic-ischemic brain damage in the immature rat[J]. Brain Res Dev Brain Res, 2001,126(1):117-120.

[7] Jensen TP, Buckby LE, Empson RM. Expression of plasma membrane Ca2+ATPase family members and associated synaptic proteins in acute and cultured organotypic hippocampal slices from rat[J]. Brain Res Dev Brain Res, 2004,152(2):129-136.

[8] Abas F, Alkan T, Goren B, et al. Neuroprotective effects of postconditioning on lipid peroxidation and apoptosis after focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats[J]. Turk Neurosurg, 2010,20(1):1-8.

[9] Warach S, Latour LL. Evidence of reperfusion injury, exacerbated by thrombolytic therapy, in human focal brain ischemia using a novel imaging marker of early blood-brain barrier disruption[J]. Stroke, 2004,35(11 Suppl 1):2659-2661.

[10] Sehgal P, Szalai P, Olesen C, et al. Inhibition of the sarco/endoplasmic reticulum (ER) Ca2+-ATPase by thapsigargin analogs induces cell death via ER Ca2+depletion and the unfolded protein response[J]. J Biol Chem, 2017,292(48):19656-19673.

[11] Ranasinghe AM, McCabe CJ, Quinn DW, et al. How does glucose insulin potassium improve hemodynamic performance? Evidence for altered expression of beta-adrenoreceptor and calcium handling genes[J]. Circulation, 2006,114(Suppl 1):1239-1244.

[12] Chin D, Means AR. Calmodulin: a prototypical calcium sensor[J]. Trends Cell Biol, 2000,10(8):322-328.

[13] Bannai H, Levi S, Schweizer C, et al. Activity-dependent tuning of inhibitory neurotransmission based on GABAAR diffusion dynamics[J]. Neuron, 2009,62(5):670-682.

[14] Kook SY, Seok Hong H, Moon M, et al. Disruption of blood-brain barrier in Alzheimer disease pathogenesis[J]. Tissue Barriers, 2013,1(2):e23993.

[15] Miyakawa T, Leiter LM, Gerber DJ, et al. Conditional calcineurin knockout mice exhibit multiple abnormal behaviors related to schizophrenia[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003,100(15):8987-8992.

[16] Ermak G, Davies KJ. Chronic high levels of the RCAN1-1 protein may promote neurodegeneration and Alzheimer disease[J]. Free Radic Biol Med, 2013,62:47-51.