Sphk1在舌鳞状细胞癌组织中的表达及其对舌癌细胞生物学行为的影响

张惠敏，吴德报，向旭，杨立，沈军

(1天津医科大学，天津300000；2天津市口腔医院)

口腔鳞状细胞癌(OSCC)在口腔癌中所占比例高达90%[1]，其中又以舌鳞状细胞癌(TSCC)最常见。TSCC恶性度高、侵袭性强，患者预后差，5年生存率仅50%左右[2]。因此，迫切需要寻找新的高效的TSCC诊断与治疗分子标记物。鞘氨醇激酶(Sphk)是调节鞘脂代谢的关键因子，在人体中有Sphk1和Sphk2两种亚型，其中Sphk1具有癌基因特性，参与肿瘤形成，在多种肿瘤中过表达，并与患者的预后密切相关[3,4]。目前,关于Sphk1在TSCC发生发展过程中作用的报道较少。2016年5月～2017年4月，我们应用免疫组化法检测Sphk1在TSCC中的表达，并分析其表达水平与临床病理特征的关系，同时采用Sphk1抑制剂N，N-二甲基鞘氨醇(DMS)干预舌癌Tca8113P160细胞，观察其对舌癌细胞增殖、迁移及侵袭能力以及上皮间质转化(EMT)相关蛋白E-cadherin、N-cadherin表达的影响，探讨Sphk1在TSCC发生发展过程中的作用及机制。

1　资料与方法

1.1　临床资料

随机选取2006～2017年于天津市口腔医院行手术治疗的TSCC患者标本50例，口腔白斑病标本28例，同期切取的癌旁正常舌黏膜标本(距原发灶边缘≥1.5 cm)10例。TSCC患者术前均未行放化疗及其他辅助治疗，术后均经病理证实。根据UICC(2002)TNM分期标准确定临床分期，Ⅰ+Ⅱ期18例，Ⅲ+Ⅳ期32例。36例同期行颈淋巴清扫术，其中颈淋巴转移25例，均未发现远处器官转移。

1.2　细胞培养方法

舌癌Tca8113P160细胞由天津市口腔医院中心实验室传代保存。向细胞中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，37 ℃、5% CO2培养箱内传代培养。收集对数生长期细胞用于实验。

1.3　TSCC、白斑及正常舌黏膜组织中Sphk1表达检测

采用免疫组化染色法。将TSCC、白斑及正常舌黏膜石蜡标本切片,经烘片、脱蜡至水后微波热修复抗原(枸橼酸抗原修复液)，血清封闭30 min;加入一抗，4 ℃过夜;加二抗，DAB显色，PBS水洗终止显色;苏木素复染，封片，留镜检。高倍镜下，每张切片随机选取5个视野计阳性细胞数，取均值。根据阳性细胞百分比计分：<25%计1分，26%～50%计2分，51%～74%计3分，>74%计4分；根据细胞染色强度计分：未着色或呈淡黄色为0分，棕黄色为1分，棕褐色为2分；两项计分乘积0～3为低表达，4～8为高表达。以上工作由两位富有经验的病理医师采用双盲法判定。

1.4　细胞增殖能力观察

采用CCK-8法。取Tca8113P160细胞悬液，接种于96孔培养板，每组设6个复孔。细胞贴壁生长达孔底60%时，将细胞分为DMS组和对照组，DMS组加入5、10、20、50、100 μmol/L DMS，对照组加入无药物培养基，分别干预24、48、72 h，结束后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育2 h。另设空白对照组，加入培养基和CCK-8溶液，不加入细胞。使用酶标仪于450 nm波长处测定OD值。

1.5　细胞迁移、侵袭能力观察

采用Transwell实验。迁移实验：将Tca8113P160细胞按6×105/孔接种于6孔培养板，将细胞分为DMS组和对照组。以细胞24 h的DMS药物半抑制浓度(IC50)23.26 μmol/L作为DMS组的干预浓度，对照组加入无药物培养基。培养24 h后，加入胰酶消化重悬，调整细胞密度为2×105/mL。取200 μL接种于Transwell小室上室，下室加入500 μL含20%胎牛血清的培养基。培养24 h后取出小室，固定、染色，显微镜下随机选取10个视野计细胞数。侵袭实验：将Matrigel胶用RMPI-1640培养基按1∶8稀释，铺于Transwell小室的上室面，其余步骤同迁移实验。

1.6　细胞中Sphk1、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达检测

采用Western blotting法。细胞接种于培养皿，将细胞分为DMS组和对照组，干预措施同Transwell实验。提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度；SDS-PAGE凝胶电泳，转PVDF膜；封闭1 h后加入一抗，4 ℃过夜，TBST洗膜；加二抗，室温孵育70 min；化学发光法显色，定影。Image J图像处理软件分析灰度值。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/同一样本内参条带的灰度值。

1.7　统计学方法

2　结果

2.1　TSCC、白斑及正常舌黏膜组织中Sphk1表达比较

Sphk1主要表达于细胞胞质，阳性部位主要呈淡黄色、棕黄色至深褐色。Sphk1在TSCC、白斑及正常舌黏膜组织中的高表达率分别为62.0%、42.9%、0，TSCC组织高于白斑及正常舌黏膜组织(P均<0.01)。

2.2　不同临床病理特征患者Sphk1表达情况比较

临床分期Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移、T3+T4分期、中低分化程度患者的Sphk1高表达比例分别高于临床分期Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移、T1+T2分期、高分化程度患者(P均<0.05)；不同性别、年龄、吸烟、饮酒情况患者Sphk1高表达比例比较差异无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1　不同临床病理特征患者Sphk1表达情况比较(例)

2.3　两组细胞增殖能力比较

DMS组24、48、72 h细胞增殖OD值均低于同期对照组(P均<0.05)。见表2。

表2　两组细胞OD值比较

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.4　两组细胞迁移及侵袭能力比较

迁移实验显示，DMS组穿膜细胞数为(176.17±19.75)个，对照组为(279.83±23.45)个；侵袭实验显示，DMS组穿膜细胞数为(128.00±13.78)个，对照组为(209.67±18.82)个。DMS组穿膜细胞数均较对照组减少(P均<0.01)。

2.5　两组细胞中Sphk1、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达比较

与对照组相比，DMS组Sphk1、N-cadherin蛋白表达减少，E-cadherin蛋白表达增加(P均<0.05)。见表3。

表3　 　　　两组细胞中Sphk1、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.01。

3　讨论

研究发现，鞘脂具有信号调节作用，在肿瘤细胞代谢过程中发挥重要作用。目前，研究较多的鞘脂分子主要有神经酰胺(Cer)和鞘氨醇1-磷酸(S1P)。Cer主要抑制细胞增殖、促进细胞凋亡；而S1P与之相反，主要促进细胞增殖、抑制细胞凋亡。Cer与S1P在细胞内相互转化，并处于动态平衡，二者的平衡状态决定细胞的存亡，这种平衡状态被称为“鞘脂-变阻器”。Sphk1是鞘脂-变阻器的关键调控因子，可使Cer转化为S1P从而促进细胞存活[5]。大量研究表明，Sphk1具有癌基因特性，其活化与一系列肿瘤细胞生物学特性关系密切。过表达Sphk1的NIH3T3纤维组织母细胞在裸鼠中能够形成肿瘤[6]；转染MCF-10A正常乳腺上皮细胞使其过表达Sphk1后，细胞的增殖和侵袭能力明显增强[7]。另外，敲除Sphk1基因可致实验鼠血液内S1P水平减低，干扰Akt-mTOR信号传导通路并显著抑制4-NQO的致癌作用[8]；使用Sphk1抑制剂DMS或Sphk1 shRNA下调Sphk1表达均能显著抑制结肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力[9]。以上研究表明，Sphk1在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。目前有关TSCC与Sphk1关系的研究较少，Sphk1在TSCC发生发展中的作用及机制尚不清楚。

本研究结果显示，正常舌黏膜、白斑及TSCC组织中Sphk1的表达依次增强，且其高表达与TSCC患者的临床分期、淋巴结转移、T分期及组织学分级相关，说明随着TSCC恶性程度加剧，Sphk1表达水平升高。Li等[10]检测了142例鼻咽癌组织中Sphk1表达情况，发现有93例组织中Sphk1高表达，且其表达与肿瘤临床分期、T分期、淋巴结转移及远处转移和局部复发情况密切相关。Song等[11]发现，Sphk1在非小细胞肺癌原发灶中的表达水平较正常组织明显升高，且其表达随着肿瘤临床分期、T分期的增加和淋巴结转移而增强。本研究结果与其一致。提示Sphk1与TSCC的发生发展密切相关，其过表达可能导致细胞恶性转化。

本研究进一步从细胞水平探讨Sphk1对TSCC的作用及机制，采用Sphk1特异性抑制剂DMS抑制其表达，检测其表达下调对Tca8113P160细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响。异常增殖是肿瘤细胞恶性生物学行为之一，Sphk1可通过诱导Cer转化为S1P进而促进肿瘤细胞增殖。本研究结果显示，Sphk1活性被DMS抑制后，Tca8113P160细胞的增殖能力减弱。Zhao等[12]发现，头颈癌JHU-22细胞中Sphk1活性被抑制后，细胞内Cer积聚，进一步抑制Bcl-2活化，促进肿瘤细胞凋亡，抑制细胞增殖。由此推测，舌癌细胞的增殖能力减弱可能与Sphk1活性被抑制后，细胞内Cer水平增高有关，但具体机制还有待进一步探讨。

侵袭及转移是TSCC细胞的主要特征之一，Sphk1在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中发挥重要作用[13]。本研究结果显示，在迁移及侵袭实验中，Sphk1表达下调后，穿膜细胞数较对照组均减少，说明下调Sphk1表达后细胞的迁移及侵袭能力受到明显抑制。另外，EMT在OSCC侵袭及转移过程中起关键性作用。EMT发生的标志是上皮标记物E-cadherin的表达减少或丧失，伴随N-cadherin、Vimentin等间质标记物的表达上调[14]。Liu等[15]发现，过表达Sphk1的肝癌HepG2细胞可通过自噬溶酶体通路促进E-cadherin降解，增加N-cadherin表达，诱导EMT发生，进而促进细胞迁移及侵袭。诸葛春风等[16]采用DMS抑制结肠癌细胞Sphk1表达，发现Vimentin表达下调，而E-cadherin水平上调，细胞EMT发生逆转，同时削弱了细胞的迁移能力。由此推测，Sphk1下调介导的迁移、侵袭抑制作用可能与EMT相关。本研究显示，下调Sphk1表达后，EMT相关蛋白E-cadherin表达升高、N-cadherin表达下降。说明Sphk1下调介导的Tca8113P160细胞迁移及侵袭能力下降与EMT相关。

综上所述，Sphk1在TSCC组织中呈高表达，其表达下调后细胞的增殖、迁移和侵袭能力均受到抑制，其介导的细胞迁移和侵袭能力的降低可能与EMT相关。通过进一步探讨Sphk1在TSCC发生发展过程中的作用机制，有望为TSCC的诊断与治疗提供新的靶点。

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