染色体的识别及核型特征分析

邹　禹,郑　娇,张　静,刘贤德,王志勇,蔡明夷

(集美大学 水产学院,农业部东海海水健康养殖重点实验室,福建 厦门 361021)

1　材料与方法

1.1　实验材料及染色体制备

1.2　染色体制片的染色

染色体制片分别用碘化丙啶(PI)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和硝酸银染液进行染色．PI和DAPI染色参考郑娇等[12]的方法．硝酸银染色(银染)根据Howell等[13]的方法略作修改:染色体制片平放于50 ℃湿润培养皿中;明胶显影液和50%(质量分数)硝酸银溶液按1∶2(体积比)混匀后滴加到载玻片上,盖上盖玻片;待反应液呈金褐色时取出制片,去离子水冲洗后用5%(质量分数)Na2S2O3溶液终止反应．

1.3　FISH

图1　染色体的PI染色核型图(a)和3D-光强度图(b)Fig.1 Karyotype image with PI staining (a) and 3D-optical density histogram (b) of M. miiuy chromosomes

采用FISH技术定位18S rDNA、5S rDNA和端粒序列在染色体上的分布位置．其中,2种rDNA片段均利用PCR扩增获得．DNA提取、PCR引物设计、PCR体系及程序参照郑娇等[12]的方法．端粒序列通过无模板扩增获得,引物为(TTAGGG)5和(TAACCC)5[14]．上述PCR产物用缺口平移试剂盒(Roche公司)制备生物素或地高辛标记探针．探针变性、染色体制片变性、探针与染色体制片杂交、杂交后洗涤、信号放大、复染和封片等步骤参照蔡明夷等[15]的方法．

1.4　镜检及数据分析

染色体的显微图像利用荧光显微镜(Olympus BX53)观察．分散良好的中期染色体用电荷耦合元件(CCD)图像传感器(Olympus DP80)拍摄．用IPP 6.0软件分析染色体图像,测量染色体的长度、宽度、面积、累积光密度(IOD)和3D-光强度[16]．综合各项测量数据完成染色体配对,并按相对长度降序排列出核型图，用Adobe Photoshop CC软件辅助完成．

2　结果与分析

2.1　核型图像分析

2.2　核型数据分析

选取5个数目完整、分散良好的中期相,测量染色体的相对长度、相对面积和PI染色的相对IOD,并计算各参数的平均值,结果见表1．其中,1号染色体的相对长度为(5.542±0.280)%,24号染色体相对长度为(2.756±0.026)%；染色体的相对长度、相对面积和相对IOD的分布均比较连续,但三者的排序并不一致．

表1　染色体的相对长度、相对面积和相对IOD

%

2.3　染色体特征识别

DAPI染色结果如图2(a)所示：染色体呈现荧光强度不均匀,特别是在1号染色体距离着丝粒约1/3臂长处呈现出明显的暗带．银染结果如图2(b)所示:每个间期核有1～2个深染的核仁组织区域(NOR);每个中期相染色体组有1对深染的NOR,位置与DAPI染色的暗带相当．18S rDNA和5S rDNA双色FISH结果如图2(c)所示:18S rDNA和5S rDNA均只有1对位点,分别位于1号染色体DAPI暗带区域和2号染色体着丝粒区域．端粒序列FISH结果如图2(d)所示:端粒的荧光信号在所有染色体上均特异地出现在端部区域,未发现臂间端粒信号;除部分端粒信号略微弱外,总体信号强度较均匀．

(a) DAPI 染色,箭头所指为DAPI暗带;(b) 银染,箭头所指为NOR;(c) 18S rDNA和5S rDNA双色FISH;(d) 端粒序列FISH．标尺为10 μm．图2　染色体的中期相图Fig.2 The metaphase image of M. miiuy chromosomes

3　讨　论

3.1　染色体识别

相对于其他脊椎动物与植物而言,海水鱼类染色体研究发展比较滞后．一方面是由于染色体制备需要细胞分裂旺盛的活体材料,而海水鱼类取样相对陆生动植物困难;另一方面是由于海水鱼类染色体普遍有规格小、长度连续、标记匮乏等特点,且适用于哺乳动物的G带和Q带技术往往不能成功应用于鱼类,导致海水鱼类染色体识别较困难[17]．为了提高鱼类染色体辨识水平,研究人员致力于开发各种技术,如复制带、限制性内切酶显带、自身基因组荧光原位杂交(self-GISH)等[12,17]．

PI是DNA定量中最常用的荧光染料,对DNA染色几乎没有选择性．染色体经PI染色后呈现荧光强度不均匀的特点,可能是DNA在染色体不同部位浓缩水平存在差异的结果[18]．本研究利用PI染色方法发现染色体呈现强度不均匀的荧光，染色体不同位置的荧光强度有一定差异,呈现出特定的荧光强度分布模式;同源染色体间荧光分布模式虽然略有差异,但总体小于非同源染色体之间的差异．利用IPP 6.0软件获得的3D-光强度图可以更直观地显示荧光染色强度的二维分布,为染色体的人工识别和配对提供了丰富的信息,同时为进一步开发鱼类染色体自动分析系统奠定了基础．相比郑娇等[12]基于self-GISH和图像分析的染色体识别方法,本方法操作更简便．

表2　石首鱼类rDNA FISH定位结果

Tab.2　Chromosomal organization of rDNA by FISH in Sciaenidae

物种18SrDNA5SrDNA对数位置a对数位置a参考文献厦门白姑鱼(Argyrosomusamoyensis)11st,PRX13rd,TER[22]棘头梅童鱼(Collichthyslucidus)b11st,STL(F);1st,P(M)11st,STL(F);1st,P(M)[23]大黄鱼(Larimichthyscrocea)118th,TER9～10[22]黄姑鱼(Nibeaalbiflora)11st,PRX21st,TER;4th,STL[7]眼斑拟石首鱼(Sciaenopsocellatus)11st,PRX23rd,STL;8th,PRX[24](M.miiuy)11st,PRX12nd,TER本研究

注：a.命名参考文献[24]，TER表示t染色体的着丝粒端,PRX表示近着丝粒区域,P表示短臂,STL表示亚端部;b.棘头梅童鱼的雌(F)、雄(M)核型不一致．

FISH是20世纪80年代末发展起来的分子细胞遗传学技术，利用核酸杂交与免疫放大定位目标探针在染色体上的位置,从而将染色体研究推进到分子水平[20]．rDNA是最常用作FISH探针的DNA序列之一．真核生物的rDNA包括45S rDNA和5S rDNA两种独立基因簇：45S rDNA重复单位包括28S rDNA、18S rDNA和5.8S rRNA序列和间隔区(ITS1和ITS2)；5S rDNA重复单位包括5S rDNA序列和间隔区[21]．45S rDNA FISH通常利用部分序列作探针(如18S rDNA),而5S rDNA FISH常用编码序列和部分间隔区作探针．迄今,利用FISH对18S rDNA和5S rDNA位点进行过定位的石首鱼类共6种，如表2所示：石首鱼类18S rDNA位点分布数目相对保守,除大黄鱼和雄性棘头梅童鱼外,均为单对位点,分布于1号染色体近着丝粒区域；相比之下,5S rDNA位点的分布模式在石首鱼类不同种间的差异要大得多,不仅表现在位点数目上,也表现在染色体的相对位置上．导致rDNA位点位置差异的机制可能是转座子的作用或同源染色体的不平衡交换等[25-26]．基于石首鱼类的核型和18S rDNA分布模式很保守的特点,我们推测与5S rDNA相关的转座子可能是导致其数目和位置变异的主要原因．

4　结　论

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