星点设计－响应面法优化浸泡型桑葚果酒制作工艺

孙 敏 ，田 野 ，崔高超 ，魏腾飞 ，杨 芳

药食同源的桑葚因其果肉多汁、色泽艳丽、香气幽雅、色素含量高且稳定，是酿酒的极佳原料［1］。桑葚中黄酮类化合物具有增强毛细血管强度、抗自由基、抗病毒、抗炎、调节血脂等生物学活性［2－8］。 桑葚水解物含槲皮素－3－O－芸香苷、槲皮素己糖苷、槲皮素鼠李糖基己糖苷、山奈酚、鼠李糖苷、花青素－3－O－葡萄糖苷和花青素－3－O－芸香苷具有抑制膳食丙烯酰胺诱导的活性氧过度产生，恢复细胞线粒体膜电位，抑制线粒体膜脂质过氧化和谷胱甘肽的消耗，对抗膳食丙烯酰胺引发的细胞毒性，发挥保护细胞的作用［9］。目前，桑葚果酒的加工方法有浸提法和发酵法。浸提法以桑葚为原料，选择合适的酒基进行浸泡。乙醇可以将桑葚中许多有益的成分萃取到酒中，这样不仅将不易存放的桑葚保存，还能将桑葚的保健成分萃取出来。果酒中的总糖、总酸都是决定果酒口感的重要风味物质。有机酸具有抑菌、抗病毒、增加冠动脉流量、抑制脑组织脂质过氧化等作用。

星点设计响应面优化法是一种新型的试验设计方法。较均匀设计和正交实验设计，星点设计响应面优化法更能够灵敏地考察各因素间的交互作用，精确度更高，近些年逐渐被用于食品科学试验的设计［10，11］。本研究通过星点设计响应面优化法来对浸泡型桑葚果酒制作条件进行设计，选择料液比、酒基乙醇体积分数、桑葚粉碎时间为自变量，桑葚果酒总糖、总酸、总黄酮、感官综合评分作为因变量，对自变量各因素水平进行多元线性回归和多项式拟合，通过数学模型进行预测最佳浸泡型桑葚果酒制作工艺参数。

1　材料与方法

1.1　材料

桑葚：大十新鲜桑葚，产自陕西省安康市汉滨区张滩镇。酒基为市售二锅头白酒（60%，V／V）。

1.2　仪器

SP－723型分光光度计 （上海光谱仪器有限公司）、UPT－II超纯水机 （四川优普超纯科技有限公司）、ALC－210.4型微量分析天平 （德国赛多利斯公司）、Legend Micro17R微量冷冻高速离心机 （美国Thermo公司）、PHS－3C pH计 （上海仪电科学仪器股份有限公司）。

1.3　药品与试剂

30～60目聚酰胺、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化铵、无水葡萄糖标准品、石油醚、无水硫酸钠、氯化钠、邻苯二甲酸氢钾、乙醇、乙酸均为分析纯，甲醇、槲皮素标准品均为色谱纯。

1.4　方法

1.4.1浸泡型桑葚果酒总糖含量的测定 采用3，5－二硝基水杨酸法（DNS 法）测定［12］。 取一定量的待测桑葚果酒样品，装入离心管中，以3 000 r／min的转速离心5 min，取0.5 mL放入100 mL的三角瓶中，加入 7.5 mL的去离子水和 5 mL 6 mol／L的HC l，置于68℃水浴中加热水解15 min。待其冷却后，用6 mol／L的NaOH中和多余的酸。用去离子水将其定容到25 mL的容量瓶中混匀，即得待测液。

葡萄糖标准溶液配制（1.0 mg／mL）：在分析天平上准确称取0.100 0 g分析纯葡萄糖（预先在105℃干燥至恒重），溶于去离子水中。依次移取0、0.2、0.4、0.8、1.2 mL 标准葡萄糖工作液、2.0 mL 去离子水于6个5 mL比色管中，加去离子水补足至2 mL，再在每个容量瓶中加入1.5 mL显色剂DNS，摇匀后将6个容量瓶放在沸水浴中加热5 min，立即冷却。用去离子水定容至25 mL，摇匀。以去离子水显色反应液做空白调零，用1 cm比色皿在540 nm处测其吸光度，绘制标准工作曲线。

总糖的测定：取20支25 mL的刻度试管编号，每管移取1 mL浸泡型桑椹果酒多糖的待测液、加去离子水补足至2 mL，再在每个容量瓶中加入1.5 mL显色剂DNS。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线的方法相同。

总糖含量（g／L）＝查曲线所得水解后的还原糖（g／L）×稀释倍数（100×25）×0.9

1.4.2浸泡型桑葚果酒总酸含量的测定 用邻苯二甲酸氢钾作基准物质标定NaOH溶液。桑葚果酒12 000 r／min离心10 min后，移取上清液2 mL至离心管。用氢氧化钠标准溶液进行滴定，利用pH计来调节终点电位与预控电位。滴定终点电位是8.3［13］。记录此时消耗的氢氧化钠的体积。按下列公式计算桑葚果酒总酸含量：总酸含量（g／L）＝C×Vk×V1／V2，其中，C 为氢氧化钠标准溶液浓度（g／mL），Vk为柠檬酸系数［14］，V1为氢氧化钠标准溶液消耗体积（mL），V2为桑葚果酒上清液取样体积（L）。

1.4.3浸泡型桑葚果酒总黄酮的测定 采用聚酰胺吸附－硝酸铝显色法测定［15］。聚酰胺预处理：用90%乙醇浸泡，不断搅拌，除去起泡后装柱。用3倍体积的90%乙醇洗脱，洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣。依次用2倍体积5%氢氧化钠溶液、1倍体积的去离子水、2倍体积10%乙酸水溶液洗脱，最后用去离子水洗脱至pH中性，备用。

标准曲线的建立：准确称取干燥的槲皮素标准品［16］10.60 mg 于 25 mL 容量瓶中，用 70%甲醇溶解，定容至刻度，得到浓度为424.0μg／mL的槲皮素标准溶液。 分别准确吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL槲皮素标准溶液于10 mL具塞试管中，用30%乙醇定容至5 mL，然后向每管中分别加入0.3 mL 5%NaNO2，摇匀后静置 5 min，分别加入 0.3 mL 10%Al（NO3）3，摇匀后静置 6 min，再分别加入 2 mL 1 mol／L NaOH，用30%乙醇定容至刻度，摇匀后静置20 min，于510 nm处测定吸光度，以空白试剂为参比。

将颗粒状聚酰胺混悬于水中，使其充分膨胀，然后装柱20 mL。准确吸取1.0 mL桑椹果酒样品，经3 500 r／min离心10 min加入30～60目的聚酰胺层析柱中。用30 mL 70%甲醇洗脱，流速72滴／min，从甲醇溶液滴入水溶液中之后开始收集洗脱液，得到1.5 mL洗脱液。准确吸取4.0 mL洗脱液按标准曲线制作方法进行反应，显色测定。为扣除底色的影响，取 4.0 mL 洗脱液用 30%乙醇稀释至 10.0 mL，作为参比。

1.5　响应面设计

在前期预试验基础上，采用响应面法（RSM）对影响浸泡型桑葚果酒制作的主要因素料液比（V／V，下同）、乙醇体积分数（%）和粉碎时间（min）3个因素为响应因素进行优化。每个因素设计5个水平，分别用代码-α、-1、0、1、α（α＝1.682）表示，设计因素与水平见表1。以浸泡型桑葚果酒总糖、总酸、总黄酮、感官综合评分为响应值进行试验安排。

表1　星点设计的因素与水平

1.6　浸泡型桑葚果酒感官综合评价

浸泡型桑葚果酒制备完成，从果酒的色泽、香气、滋味、风格4个方面对桑葚果酒进行评分，评分标准见表2。

2　结果与分析

2.1　葡萄糖的测定线性关系考察

葡萄糖标准液的浓度为1 mg／mL，以标准液的浓度 0、0.008、0.016、0.024、0.032、0.04、0.048 mg／mL为横坐标，以其对应的吸光度（OD值）为纵坐标，绘制标准曲线，得直线回归方程为 Y＝14.179X－0.000 7（R2＝0.994 4），表明在线性范围内线性关系良好。

表2　浸泡型桑葚果酒感官评定标准

2.2　槲皮素的测定线性关系考察

槲皮素标准品浓度为424.0μg／mL，以标准品的浓度 0、8.48、16.96、25.44、33.92、42.40、50.88、59.36 mg／L为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标，绘制标准曲线， 得直线回归方程为 Y＝0.007 2X－0.002 3（R2＝0.999 7），表明在线性范围内（8.48～59.36 mg／L）线性关系良好。

2.3　星点设计试验结果及响应面分析

依据星点设计－响应面法试验方案进行3因素5水平试验，星点设计试验安排与桑葚果酒总糖、总酸、总黄酮、感官综合评分4个响应值结果见表3。

表3　星点设计试验结果

2.4　模型拟合及工艺优化

以浸泡型桑葚果酒总糖、总酸、总黄酮、感官综合评分分别为因变量，使用Design－Expert软件采用二次多项式非线性模型对各影响因素和指标进行回归计算，其方程如下：

2.5　响应曲面与等高线

采用Design expert 7软件绘制二次多项式模型中X1、X2、X3中任意2因素对各评价指标的三维效应曲面（其余自变量设为中心点值），见图1至图4。通过响应面三维图，可直观地反映各因素的交互作用对响应值的影响，有助于确定最佳浸泡工艺参数范围。

图1　粉碎时间和料液比对浸泡型桑葚果酒总糖影响的三维曲面和等高线

图3　粉碎时间和乙醇体积分数对浸泡型桑葚果酒总黄酮影响的三维曲面和等高线

2.6　验证试验

经Design expert 7软件处理后得到的最佳条件为料液比为 59.70∶100，乙醇体积分数为 50.85%，粉碎时间为0.89 min。在此条件下进行验证试验，浸泡型桑葚果酒共3份，按照“1.4”各项方法进行试验，结果见表4。根据优化浸泡工艺参数，平行制备3份样品，所得浸泡型桑葚果酒各指标实测值与理论预测值接近，表明建立的回归方程预测性良好。

表4　优化浸泡制作工艺验证结果

图2　乙醇体积分数和粉碎时间对浸泡型桑葚果酒总酸影响的三维曲面和等高线

图4　乙醇体积分数和料液比对浸泡型桑葚果酒感官综合评分影响的三维曲面和等高线

3　小结

选择料液比、乙醇体积分数、粉碎时间为自变量，浸泡型桑葚果酒总糖、总酸、总黄酮、感官综合评分作为因变量，对自变量各因素水平进行多元线性回归和多项式拟合。通过星点设计－响应面法优化浸泡型桑椹果酒制作工艺，得到的最佳浸泡制作工艺参数为料液比 59.70∶100，乙醇体积分数 50.85%，粉碎时间0.89 min。浸泡型桑葚果酒预测值分别为总糖 28.00 g／L、总酸 1.82 g／L、总黄酮 101.76 mg／L、感官综合评分90.00。在此条件下进行验证试验，浸泡桑葚果酒共3份，各项指标实测值分别为总糖27.27 g／L、总酸 1.87 g／L、总黄酮 99.92 mg／L、感官综合评分88.00分。实测值与模型预测值间的偏离率分别为－2.6%、2.7%、－1.8%、－2.2%。根据优化浸泡制作工艺参数，平行制备3份样品，所得浸泡型桑葚果酒各指标实测值与理论预测值接近，表明建立的回归方程预测性良好。

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