缬沙坦对阿霉素所致心肌细胞损伤保护作用的初步研究

刘丽文 阳志军 俸艳英

阿霉素（doxorubicin，DOX）是一种有效且常用于卵巢癌、子宫内膜癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤化疗的蒽环类药物［1］，心脏毒性是蒽环类药物最常见和不可避免的毒副作用［2］，因此在肿瘤化疗中的使用有累积剂量限制，其心脏毒性的预防和管理是目前研究关注的临床热点问题之一。然而，DOX引起心脏毒性的机制尚未明确，其中氧化应激和心肌细胞凋亡可能是重要的机制［3］。氧化应激是指机体遭受各种有害物质刺激时，组织或细胞内氧自由基增多且清除能力降低，导致机体氧化和抗氧化能力失衡，与多种心血管疾病发生、发展密切相关［4］。目前研究认为阿霉素致心肌损害是由于蒽环类药物螯合铁离子后触发超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）等活性氧生成，导致羟基自由基形成，诱导心肌细胞膜脂质过氧化，引起心肌细胞损伤［5］。有研究显示抗氧化剂处理对阿霉素介导的心脏毒性起保护作用［6］。而细胞凋亡是由基因控制的一种有序的自主死亡过程，也是导致心肌损伤的主要方式，是扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）心力衰竭、心肌细胞丢失和心功能不全的重要机制［7］。

缬沙坦（valsartan，VAT）是血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂（angiotensinⅡreceptor antagonists，ARBs），对心肌细胞有保护作用，ARBs可选择性作用于心脏的AT1受体，逆转心室和血管壁重构，促进心脏功能恢复［8］。越来越多的研究表明，ARBs同时具有抗炎、降低心肌细胞凋亡水平等作用，可减弱阿霉素诱导的心脏功能障碍［9］。本研究采用DOX作用于H9C2心肌细胞建立心肌细胞损伤模型，初步探讨VAT保护DOX所致的心肌细胞损伤的相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

H9C2心肌细胞株购自中国科学院上海细胞库。细胞计数试剂盒8（cell counter kit-8，CCK-8）购自日本Dojindo Lab公司，DOX购自深圳万乐药业有限公司，缬沙坦片购自海南皇隆制药股份有限公司，DMEM培养基、特级胎牛血清（FBS）均购自美国Coring公司，流式凋亡检测试剂盒购自美国BD公司，流式周期检测试剂盒购自南京凯基生物技术公司。

1.2 细胞培养

H9C2心肌细胞在37℃、5%CO2条件下，培养于含10%胎牛血清的DMEN培养基中。

1.3 CCK-8法检测H9C2心肌细胞存活率

取对数生长期的H9C2心肌细胞，胰酶消化后按1250个/孔接种于96孔板中，培养至80%融合度，以PBS处理的H9C2心肌细胞为对照组，根据实验目的进行以下处理：⑴分别给予不同浓度（0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L）的DOX培养12 h和24 h；⑵分别给予不同浓度（5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L）VAT预处理24 h后，PBS洗涤2次，再用上述确定的最佳DOX浓度培养24 h；⑶采用前两个步骤确定的DOX及VAT浓度处理H9C2心肌细胞，观察不同作用时间（12h、24 h、36 h和48 h）其对H9C2心肌细胞存活率的影响；每个处理因素设置5个复孔。以PBS处理的H9C2心肌细胞为对照组。终止培养后，每孔加入10μLCCK-8，轻摇，37℃孵育90min，采用酶标仪（λ=450）记录各孔吸光度（OD值）。按下列公式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（处理组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。实验重复3次。

1.4 流式细胞仪检测H9C2心肌细胞凋亡率

H9C2心肌细胞按5×105个/孔接种于6孔板，在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养至80%融合度，按实验需要分别处理H9C2心肌细胞：对照组为PBS处理的H9C2心肌细胞，DOX组给予1μmol/L DOX，DOX+VAT组给予1μmol/L DOX+10μmol/L VAT，VAT组给予10μmol/L VAT。PBS清洗后0.25%胰酶消化，收集细胞，以1 000 r/min离心5 min，弃上清液，按试剂盒提供的步骤进行PI-Annexin V染色，流式细胞仪检测H9C2心肌细胞凋亡率。

1.5 流式细胞仪检测H9C2心肌细胞周期

将H9C2心肌细胞饥饿24 h后接种至培养瓶中，待细胞生长至约80%融合度，按实验要求分别处理H9C2心肌细胞：对照组为PBS处理的H9C2心肌细胞，DOX组给予1μmol/L DOX，DOX+VAT组给予1μmol/LDOX+10μmol/LVAT，VAT组给予10μmol/L VAT。PBS清洗后0.25%胰酶消化，收集细胞，以1000 r/min离心5min，弃上清液；预冷PBS再洗涤2次，离心收集细胞，预冷75%乙醇4℃固定细胞，第2天PBS水化、洗涤细胞，弃PBS，残留PBS约50μL重悬细胞，加入RNA酶100μL，置于37℃水浴锅孵育30min；最后加入400μL PI染液4℃避光染色60 min，在流式分析仪上检测分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），若整体差异有统计学意义，进一步的两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DOX对H9C2心肌细胞存活率的影响

0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L浓度下的DOX作用H9C2心肌细胞12 h后，细胞存活率分别为（93.1±2.5）%、（89.0±1.3）%、（87.5±2.8）%、（85.5±2.2）%；作用24 h后，细胞存活率分别为（84.5±4.4）%、（75.5±5.6）%、（67.4±2.9）%、（60.4±2.9）%。与对照组的细胞存活率100%比较，两个时间点各浓度DOX作用H9C2心肌细胞，其细胞存活率均降低（P＜0.01），且随药物浓度增加，细胞存活率越低。DOX作用于H9C2心肌细胞24 h的IC50值为（8.44±1.38）μmol/L，IC25值为（1.32±0.47）μmol/L。

2.2 DOX对H9C2心肌细胞凋亡的影响

不同浓度（0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L）DOX处理H9C2心肌细胞24 h，流式细胞仪检测发现，0.5μmol/L DOX作用可引起H9C2心肌细胞凋亡，细胞凋亡率为（8.44±1.12）%，但与对照组细胞凋亡率（4.86±0.59）%比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；当DOX浓度为1μmol/L、2μmol/L时，H9C2心肌细胞凋亡率分别为（11.94±2.07）%、（17.86±5.11）%，与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 不同浓度DOX对H 9C2心肌细胞凋亡率的影响

2.3 不同浓度VAT作用24 h对H9C2心肌细胞存活率的影响

不同浓度（5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L）VAT作用24 h后，H9C2心肌细胞存活率分别为（99.1±1.0）%、（99.0±2.0）%、（102.2±6.0）%，与对照组的细胞存活率100%比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.4 VAT预处理对DOX所致H9C2心肌细胞毒性的影响

1μmol/L DOX作用H9C2心肌细胞前，分别用5 μmol/L、10μmol/L、15μmol/L VAT预处理24 h，细胞存活率分别为（84.5±4.1）%、（89.3±4.0）%、（88.9±3.9）%，与1μmol/L DOX组的细胞存活率（74.2±3.1）%比较，各组细胞存活率升高（P＜0.01），其中当VAT浓度为10μmol/L时保护作用最大。用10μmol/L的VAT分别预处理H9C2心肌细胞12 h、24 h、36 h和48 h，细胞存活率分别为（87.9±0.6）%、（92.1±0.6）%、（91.2±0.5）%、（88.7±0.5）%，与作用24 h相比，缩短或延长作用时间细胞存活率并未显著提高（P＞0.05）。

2.5 VAT对DOX引起的H9C2心肌细胞凋亡的影响

流式细胞仪结果显示，1μmol/L DOX作用H9C2心肌细胞24 h，细胞凋亡率为（13.15±6.07）%，对照组为（4.85±5.65）%，两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；1μmol/L DOX处理细胞前用浓度为10μmol/L VAT预处理24 h，细胞凋亡率为（11.10±3.17）%，与1μmol/L DOX比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；单用10μmol/L VAT所致的细胞凋亡率为（6.57±3.22）%，与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。1μmol/LDOX+10 μmol/LVAT作用所致的细胞凋亡率高于10μmol/L VAT组，差异有统计学意义［（11.10±3.17）%vs（6.57±3.22）%，P＜0.05］，见图2。

2.6 VAT对DOX作用后H9C2心肌细胞周期的影响

流式细胞仪检测结果显示，1μmol/L DOX作用24 h后G0/G1期的心肌细胞所占比例明显高于对照组［（69.21±2.03）%vs（43.12±2.34）%，P＜0.01］；而G2/M期细胞所占比例明显低于对照组［（7.87±1.55）%vs（24.2±1.21）%，P＜0.01）］；1μmol/L DOX作用H9C2心肌细胞前，用10μmol/L VAT处理24h后G0/G1期细胞所占比例明显低于1μmol/LDOX组［（50.28±1.21）%vs（69.21±2.03）%，P＜0.01）］，而G2/M期细胞所占比例明显高于1μmol/L DOX组［（14.5±1.57）%vs（7.87±1.55）%，P＜0.01）］；10μmol/L VAT处理H9C2心肌细胞，与对照组相比，各期细胞所占比例变化不大，差异无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图2 VAT对DOX引起的H 9C2心肌细胞凋亡的影响

3 讨论

阿霉素在临床上广泛应用于子宫内膜癌、卵巢癌等恶性肿瘤化疗，但过量阿霉素可导致心肌病和慢性充血性心力衰竭等严重心脏毒性［2］。目前认为阿霉素心脏毒性机制包括活性氧自由基的产生、细胞凋亡等［3］。心肌细胞凋亡是多种心血管疾病发生、发展的重要病理生理机制之一，其信号传导通路相互影响，组成复杂的网络［10］。本研究发现阿霉素诱导的H9C2心肌细胞凋亡呈剂量与时间依赖性，当DOX浓度为1μmol/L时，作用24 h后H9C2心肌细胞开始出现明显损伤，表现为H9C2心肌细胞生长抑制、凋亡增加，细胞存活率下降至（75.5±5.6）%，细胞凋亡率由对照组的（4.86±0.59）%上升到（11.94±2.07）%。近期研究发现，阿霉素可能主要通过激活心肌氧化应激，促进活性氧蓄积等途径引起心肌细胞凋亡［11-12］。

图3 VAT对DOX作用后H9C2心肌细胞周期的影响

肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensin system，RAS）在心血管系统生理调节过程中发挥重要作用，并与多种心血管疾病发生密切相关［13］。研究显示RAS系统参与心肌损伤的过程［14］。VAT是一种血管紧张素受体Ⅱ抑制剂，具有抗炎、减低心肌细胞凋亡水平的作用。姚艳等［15］研究氯沙坦长期干预心衰，发现其能改善心脏舒缩功能。本研究发现在DOX处理前采用10μmol/L VAT预处理H9C2心肌细胞24 h，可明显抑制1μmol/L DOX引起的心肌细胞毒性作用，表现为细胞存活率升高、细胞凋亡率下降、G0/G1期细胞比例明显减少。VAT作为一种ARB类药物，主要通过与AT1受体结合，竞争性抑制血管紧张素Ⅱ的生物学效应而发挥作用。具体机制可能包括以下方面：⑴缬沙坦作为血管扩张剂降低心脏的前后负荷和室壁张力，改善促使心室重构的血流动力异常；⑵抑制心肌细胞凋亡、肥大和胶原增生；⑶抑制交感神经过度激活；⑷增强血管紧张素Ⅱ受体的良性心血管效应；⑸抑制炎症因子等［16-17］。Akolkar等［18］报道给予缬沙坦13周可改善阿霉素诱导的小鼠心脏毒性。临床研究亦发现血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂对含蒽环类药物化疗方案抗肿瘤治疗中导致的心脏毒性有潜在的心脏保护作用［19］。在最近一项荟萃分析中发现，接受蒽环类方案的肿瘤患者使用血管紧张素转化酶抑制剂或ARBs预防性给药，与安慰剂相比，发生心脏毒性的相对风险为0.11［20］，但相关机制仍不明确。因此，阐明ARBs保护阿霉素所致心肌毒性的相关机制对于阿霉素的临床应用及心脏毒性防治至关重要。但VAT通过何种途径调控细胞凋亡而发挥保护阿霉素所致心肌细胞损伤的相关机制尚未知，需进一步深入研究。

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