PARP-1对鼻咽癌CNE-2细胞迁移及侵袭能力的影响

卢其腾 曲颂 李龄 韦静妮 刘志杰 余彬彬 周磊 陈凯华 林国享 孙永楚 朱小东，5

放射可引起鼻咽癌细胞DNA损伤，包括双链和单链DNA断裂，造成细胞周期阻滞及细胞凋亡等，最终导致癌细胞死亡。但在放疗过程中，放射会激活DNA修复系统，降低放射敏感性，导致鼻咽癌细胞发生放射抗拒，引起局部复发及转移［1］。有研究提示PARP-1除具有DNA损伤识别和修复中的直接作用外，还可调节多种转录因子功能，包括p53和NF-κB等［2］；在某些癌症背景下，PARP-1与转录因子HIF1［3］和Snail1［4］相互作用，可能与细胞迁移、侵袭有关。本研究通过慢病毒沉默鼻咽癌CNE-2细胞PARP-1基因，照射后观察CNE-2细胞的迁移和侵袭情况，以探讨PARP-1对鼻咽癌CNE-2细胞迁移、侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞系与材料

人鼻咽低分化鳞状细胞癌CNE-2细胞株由中国医学科学院肿瘤研究所与广东医学院建株，购于上海复旦大学附属肿瘤医院实验中心。针对PARP-1基因（Gene ID：142；NM_001618.3）的慢病毒载体由上海吉凯基因科技有限公司设计构建，病毒转染CNE-2细胞后由本课题组传代、冻存；兔抗人多克隆抗体波形蛋白（Vimentin）购于沈阳万类生物科技有限公司；兔抗人多克隆抗体PARP-1购于美国CST公司；兔抗人GAPDH单克隆抗体购于美国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG（H+L）购自碧云天公司；Precise LINAC直线加速器购于瑞典Elekta公司；凝胶成像分析仪购自美国Bio-Rad公司；倒置显微镜购于日本Olympus公司；基质胶及Tanswell小室购于美国Corning公司。

1.2 细胞培养与分组

从-80℃冰箱取出冻存的鼻咽癌CNE-2细胞、转染阴性病毒对照细胞和转染稳定沉默PARP-1基因细胞，复苏、传代，加入10%牛胎血清的1640培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。本研究将CNE-2细胞分为空白对照组（CNE-2组）、转染阴性病毒对照组（NC组）、转染稳定沉默PARP-1基因组（LV组）和未照射组（CNE-2-0 Gy组）。

1.3 划痕愈合实验检测CNE-2细胞迁移情况

细胞用胰酶消化，收集状态良好的细胞，离心后重悬，调整细胞浓度为3×105/mL，以2 mL/孔均匀加入6孔板中培养24 h，用200μL枪头以45°在孔板上划痕，PBS轻洗脱落细胞3遍，换成1640培养基，给予10 Gy剂量照射（源皮距100 cm，采用等效膜覆于孔板盖），于0 h、48 h在显微镜下观察拍照，使用Image J软件测量、计算细胞迁移率，计算公式：细胞迁移率（%）=（0 h划痕宽度-48 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。

1.4 Transwell小室实验检测CNE-2细胞迁移和侵袭情况

将细胞撤血清培养24 h，于24孔板中加入500μL 10%牛胎血清的1640培养基，把小室置入24孔板。迁移实验为上室加入100μL细胞浓度为1x105/mL的悬液，给予10Gy剂量照射，培养48 h。侵袭实验则予上室加入100μL按1∶5稀释的基质胶并放回培养箱1 h，待基质胶凝固，再加入100μL细胞浓度为5×105/mL的悬液，给予10 Gy剂量照射（源皮距100 cm，采用等效膜覆于孔板盖），培养48 h。棉签把上室细胞清除，穿入下室的细胞以4%多聚甲醛固定30min、吉姆萨染液染色45min，显微镜下观察拍照，使用Image J软件计算下室细胞数。

1.5 Western blot实验检测CNE-2细胞PARP-1和Vimentin蛋白的表达

取对数生长期贴壁融合度约为80%的细胞，撤血清24 h，盖上等效膜，给予10Gy剂量照射，48 h后提取各组PARP-1和Vimentin总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后于100℃下变性5 min；分别于10%、8%的SDSPAGE凝胶电泳分离蛋白，100mA恒流转膜120min，5%脱脂乳粉封闭120min，分别加入1∶1000稀释的一抗中4℃孵育过夜，TBST漂洗后室温孵育于1∶1 000稀释的二抗60 min，采用凝胶成像分析仪扫描，使用Image J软件计算灰度值。

1.6 统计学方法

采用IBM SPSS Statistics 23.0软件进行数据分析，实验数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），若组间差异有统计学意义，进一步的两两比较采用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 划痕愈合实验检测CNE-2细胞迁移情况

划痕愈合实验结果显示，照射后48 h CNE-2组、NC组、LV组和CNE-2-0 Gy组的细胞迁移率分别为（79.37±5.75）%、（70.13±6.56）%、（20.83±10.91）%和（27.13±7.50）%。LV组细胞迁移率较CNE-2组和NC组低，差异有统计学意义（P<0.05）；LV组与CNE-2-0Gy组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。

图1 照射后48 h不同处理组CNE-2细胞迁移情况

2.2 Transwell小室实验检测CNE-2细胞迁移、侵袭情况

Transwell小室实验结果显示，照射后48 h CNE-2组、NC组、LV组和CNE-2-0 Gy组迁移穿入下室的细胞数分别为（60.00±2.66）个、（52.33±9.71）个、（13.67±3.51）个和（23.33±4.04）个；侵袭入下室细胞数分别为（33.00±2.00）个、（29.00±1.72）个、（6.67±2.52）个和（9.67±1.16）个。LV组迁移、侵袭入下室的细胞数分别比CNE-2组和NC组少，差异均有统计学意义（P<0.05）；LV组与CNE-2-0 Gy组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。

图2 照射后48 h不同处理组CNE-2细胞迁移、侵袭情况

2.3 Western blot实验检测CNE-2细胞PARP-1和Vimentin蛋白的表达

Western blot实验结果显示，照射后48 h CNE-2组、NC组、LV组和CNE-2-0Gy组PARP-1蛋白相对表达量分别为1.00±0.00、1.02±0.04、0.47±0.05和0.47±0.06；Vimentin蛋白相对表达量分别为1.00±0.00、0.99±0.04、0.24±0.02和0.27±0.03。LV组PARP-1蛋白、Vimentin蛋白相对表达量分别较CNE-2组和NC组低，差异有统计学意义（P<0.05）；LV组与CNE-2-0 Gy组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图3。

图3 照射后48 h不同处理组CNE-2细胞中PARP-1及Vim entin蛋白的表达

3 讨论

放疗是鼻咽癌有效的治疗手段，随着放疗技术不断进步，大部分患者可取得较好疗效。但仍有约20%的患者存在局部复发及远处转移［5］。鼻咽癌放疗后复发和转移是一个复杂过程，涉及多基因、多层次调控，探索其中的分子机制对鼻咽癌治疗及改善患者预后有重要的价值。目前已有研究证实射线会造成DNA分子损伤，激活DNA修复系统，如PARP家族。该家族由18个核蛋白组成［6-7］，其中PARP-1在碱基切除修复过程中具有核心修复功能，电离辐射所致的DNA单链损伤断裂可诱导PARP-1大量活化。本课题组前期研究提示，电离辐射的计量及时间延长可使PARP-1下游产物表达增加，修复损伤的DNA分子，减少细胞死亡，致使放射敏感性降低，并诱导自噬，最终导致放射抗拒［8］，并可能进一步分泌放射抗拒相关蛋白（如CD166）［9］，使病灶残存，成为局部复发前提，亦可能分泌促淋巴管新生分子而促进转移［10］。Vimentin是一种中间丝蛋白，在多项研究中被证明是细胞运动的重要调节因子［11］，其上调可能是上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）诱导的先决条件［12］。在乳腺上皮细胞中沉默Vimentin可导致EMT相关基因N-钙黏蛋白、酪氨酸激酶Axl、整合素β4亚基及尿激酶型纤溶酶原激活因子表达下调［13］。此外，Vimentin还可被Akt1磷酸化，从而免受半胱天冬氨酸诱导的蛋白水解，进而增强细胞迁移和侵袭能力［14］。在肺癌细胞中PARP-1基因紧挨Vimentin的启动子区域，可诱导差异性表达［15］，Vimentin高表达提示肿瘤细胞可获得更强的迁移、侵袭能力［16］。

为探讨鼻咽癌细胞中PARP-1与迁移、侵袭的关系，本研究在CNE-2细胞中沉默PARP-1基因，并给予10 Gy照射剂量，48 h后观察划痕愈合、Transwell小室迁移及侵袭、PARP-1及Vimentin蛋白表达的情况。结果发现划痕愈合实验LV组的细胞迁移能力下降，细胞迁移率较CNE-2组和NC组低；LV组Transwell小室迁移、侵袭实验穿入下室的细胞数亦较CNE-2组和NC组少，而LV组与未照射的CNE-2-0 Gy组比较，差异无统计学意义，这些生物行为学上的改变，提示PARP-1表达与鼻咽癌CNE-2细胞迁移、侵袭能力可能存在正相关。同时Western blot实验结果显示，LV组PARP-1及Vimentin蛋白表达与CNE-2组、NC组相比均下调，但LV组与未照射的CNE-2-0Gy组比较，差异无统计学意义。潜在的可能分子机制是PARP-1基因与Vimentin启动子位置紧挨，未照射的CNE-2-0Gy组PARP-1未被激活，而照射后的LV组PARP-1被干扰而表达相对下调，Vimentin的启动子未受其影响，未被激活，致使Vimentin表达相对下调［15］；降低EMT水平［12］，从而抑制鼻咽癌细胞迁移、侵袭。照射后的CNE-2组和NC组PARP-1被激活，Vimentin启动子受PARP-1影响亦被激活，Vimentin表达随之上调，并进一步正向调控EMT，从而促进鼻咽癌细胞迁移、侵袭。

综上所述，照射后PARP-1可被激活，且表达相对上调，从而促进鼻咽癌CNE-2细胞迁移、侵袭。PARP-1有望成为鼻咽癌放疗后转移新的治疗靶点，但其具体的分子机制仍需进一步深入研究。

［1］ Qu C，Zhao Y，Feng G，et al.RPA3 is a potentialmarker of prognosis and radioresistance for nasopharyngeal carcinoma［J］.JCell Mol Med，2017，21（11）：2872-2883.

［2］ Wu SL，Li YJ，Liao K，et al.2-Methoxyestradiol inhibits the proliferation and migration and reduces the radioresistance of nasopharyngeal carcinoma CNE-2 stem cells via NF-κB/HIF-1 signaling pathway inactivation and EMT reversal［J］.OncolRep，2017，37（2）：793-802.

［3］ Martin-Oliva D，Aguilar-Quesada R，O'valle F，et al.Inhibition of poly（ADP-ribose）polymerasemodulates tumor-related gene expression，including hypoxia-inducible factor-1 activation，during skin carcinogenesis［J］.Cancer Res，2006，66（11）：5744-5756.

［4］ Rodríguez MI，González-Flores A，Dantzer F，et al.Poly（ADP-ribose）-dependent regulation of Snail1 protein stability［J］.Oncogene，2011，30（42）：4365-4372.

［5］ Suárez C，Rodrigo JP，Rinaldo A，et al.Current treatment options for recurrentnasopharyngeal cancer［J］.Eur Arch Otorhinolaryngol，2010，267（12）：1811-1824.

［6］ AméJC，Spenlehauer C，De Murcia G.The PARP superfamily［J］.Bioessays，2004，26（8）：882-893.

［7］ Schreiber V，Dantzer F，Ame JC，et al.Poly（ADP-ribose）：novel functions for an old molecule［J］.NatRev MolCell Biol，2006，7（7）：517-528.

［8］ Zhou ZR，Zhu XD，Zhao W，et al.Poly（ADP-ribose）polymerase-1 regulates the mechanism of irradiation-induced CNE-2 human nasopharyngeal carcinoma cell autophagy and inhibition of autophagy contributes to the radiation sensitization of CNE-2 cells［J］.Oncol Rep，2013，29（6）：2498-2506.

［9］ 林欢，朱小东，陈泽昙，等.CD166对鼻咽癌CNE-2细胞放射敏感性的影响［J］.中国癌症防治杂志，2017，9（1）：45-49.

［10］ 邓恋，刘陶文，屈元姣，等.淋巴管密度与鼻咽癌淋巴结转移的关系［J］.实用癌症杂志，2014，29（9）：1097-1100.

［11］ Mendez MG，Kojima S，Goldman RD.Vimentin induces changes in cell shape，motility，and adhesion during the epithelial tomesenchymal transition［J］.FASEB J，2010，24（6）：1838-1851.

［12］ Ivaska J.Vimentin：central hub in EMT induction?［J］.Small GTPases，2011，2（1）：51-53.

［13］ Rodríguez MI，Peralta-Leal A，O'valle F，et al.PARP-1 regulates metastaticmelanoma throughmodulation of vimentin-induced malignant transformation［J］.PLoSGenet，2013，9（6）：e1003531.

［14］ Zhu QS，Rosenblatt K，Huang KL，et al.Vimentin is a novel AKT1 targetmediatingmotility and invasion［J］.Oncogene，2011，30（4）：457-470.

［15］ Rho JH，RoehrlMH，Wang JY.Glycoproteomic analysisof human lung adenocarcinomas using glycoarrays and tandem mass spectrometry：differential expression and glycosylation patterns of vimentin and fetuin a isoforms［J］.Protein J，2009，28（3-4）：148-160.

［16］ 李幼梅，张思仪，赵连梅，等.LIN28A、E-cadherin和vimentin在浸润性乳腺癌中的表达及其临床意义［J］.癌变·畸变·突变，2017，29（4）：304-308，312.