基于线粒体D-loop DNA序列的瓯江口鳗鲡幼苗遗传鉴定

付秀兰，谢斐昂，LUSANA James,3，陈永久,，李德伟，蒋日进

(1.国家海洋设施养殖工程技术研究中心，浙江舟山 316022；2.浙江海洋大学海洋科学与技术学院，浙江舟山 316022；3.Department of Aquatic Science and Fisheries Technology，University of Dar es Salaam，Dar es Salaam 35064，Tanzania；4.浙江海洋大学海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，农业部重点渔场渔业资源科学观测实验站，浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江舟山 316021)

在分类学上,鳗鲡隶属于硬骨鱼纲Osteichthyes、鳗鲡目Anguilliformes、鳗鲡科Anguillidae、鳗鲡属Anguilla。鳗鲡是一种逆河降海的洄游性鱼类，成鳗在海中产卵，卵孵化后随洋流迁移到江河口附近索饵。日本鳗鲡Anguilla japonica是广泛分布于日本北海道至菲律宾之间的西太平洋18种鳗鱼之一[1]，其神秘的生活史过程，复杂的繁殖生物学特征以及独特的幼鱼形态特征使人们对其产生浓厚的兴趣[2]。日本鳗鲡是一种具有重要经济价值的鱼类[3]，特别在东亚是一类很受大众喜爱的海产品。近年来，由于过度捕捞，栖息地破坏，入海口污染，以及气候变化等人为因素导致日本鳗鲡种群数量从1970年到2003年下降了大约90%，现今形势还尤为严峻[4]。因此，开展相关研究来维持和保护日本鳗鲡种群势在必行[5]。

瓯江口地处东海南部近海，该海域是鱼类索饵、产卵、繁育的良好场所，具有丰富的渔业资源。历史上，瓯江口是鳗苗的主要产地，上世纪70年代以前浙江省年产鳗苗3000多t，占全国产量3成以上[6]。近年以来，由于水利工程建设，环境污染和过度捕捞等因素，鳗苗资源总体上呈现衰退的趋势。

为了更好地对渔业资源进行管理和保护，开展种质资源鉴定尤为重要。鳗鲡线粒体DNA控制区(control region或称D-loop)具有较高的多态性，可以有效地揭示鳗鲡属内种间、甚至种内群体间的遗传变异[7-9]。本研究采用线粒体D-loop DNA序列对浙江瓯江口鳗鲡幼苗进行遗传鉴定，以期为渔业资源管理者及政策制定者提供基础资料参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本研究的鳗鲡幼苗样本于2017年3月从浙江温州瓯江口及邻近水域采集。采样地点北至清江河口，南至鳌江河口，西至楠溪江，东至洞头列岛，共包括6个采样点：楠溪江、清江、鳌江、飞云江、洞头和瓯江，具体采样地点如图1所示。样本采用95%酒精固定后带回实验室，置于-20℃冰箱中保存备用。

图1 瓯江口玻璃鳗的采样信息Fig.1 The sampling information of glass eel in the Oujiang River estuary

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA的提取

DNA序列分析样品包括34尾玻璃幼鳗，全长均为55 cm左右。此外，还有1尾成年日本鳗鲡样本采自于瓯江。采用DNeasyR血液和组织试剂盒(Qiagen，Valencia，美国)从鳗鱼尾鳍中提取基因组DNA，操作方法按照试剂盒说明。提取的DNA经过琼脂凝胶电泳检测后置于-20℃冰箱中保存备用。

1.2.2 PCR扩增和DNA测序

用于PCR的正、反向引物分别为L15625-CR 和 H84-CR[8]。PCR 采用 25 μL反应体系，包括 12.5 μL GoTaqRGreen Master Mix(Promega，美国)，正、反向引物(10 μM)各 2 μL，2 μL DNA模版，8.5 μL无菌超纯水。PCR程序：95℃预变性2 min，然后95℃变性30 s，52℃退火40 s，72℃延伸90 s，共35个循环，最后72℃再延伸10 min。采用1.5%的琼脂糖电泳检测PCR产物的浓度和纯度，PCR产物检测阳性后送至上海生工生物技术有限公司，采用ABI-PRISM 3730进行测序。

1.3 数据处理分析

采用Sequencher 5.4(Gene Codes)和BioEdit V.7.0.4.1[10]软件将测序结果进行检查、校正和序列比对。将校正、比对后的序列文件保存为“fas”类型文件。通过BLAST工具(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi)将所得的DNA序列在GenBank中进行相似性检索，得出物种的分类地位。使用DnaSP 5.0软件[11]计算DNA序列中的多态位点数(S)，单倍型多态性(Hd)、核苷酸多态性(π)，及单倍型间平均碱基差异数(k)，进行Tajima’s D 的中性检验，并分析核苷酸错配分布(Mismatch distribution)。采用Arlequin 3.5[12]进行分子方差分析(AMOVA)，并计算采样点之间的FST值。最后，采用MEGA 6.0[13]计算DNA序列之间的Kimura双参数遗传距离,再构建邻接(NJ)聚类树。

2 结果

通过对获得的800 bp线粒体D-loop DNA序列在Gen-Bank中BLAST比对，发现所有的序列与日本鳗鲡的D-loop序列相似度最高(＞99%)。34个样本的D-loop序列分别代表34个不同的单倍型；DNA序列中的多态位点数目(S)为74；单倍型多态性(Hd)为 1.0±0.007；核苷酸多态性(π)为 0.011±0.000 8；单倍型间平均碱基差异数(k)为8.67。

6 个采样点之间的遗传差异均很小(FST≤0.023；P＞0.05)[11]。楠溪江与洞头样本间的FST指数最大，为0.023，其次为楠溪江与飞云江(FST=0.018)，瓯江与飞云江的FST指数为0.006，其余采样点间几乎都没有遗传差异(表1)。AMOVA分析结果显示，种群内的分子变异率很高(102%；d.f=5)，而种群间的分子变异率很小(-2.8%；d.f=28)。此外，NJ聚类关系显示，6个采集点鳗鲡单倍型互相交错，没有形成明显的与地理相关的谱系类群(图 2)。

图2 幼鳗D-loop单倍型的NJ聚类树Fig.2 The NJ tree of D-loop haplotypes of eel larvae

表1 不同采集地点幼鳗样本的遗传差异指数(FST)Tab.1 The genetic differentiation index(FST)of eel among different sampling sites

瓯江口日本鳗鲡34个样本的Tajima’s D中性检验显示，D=-1.982 96(P＜0.01)。此外，核苷酸错配分布曲线呈单峰状(unimodal distribution)，如图3所示。

3 讨论

传统上对鳗鲡苗种鉴定的方法主要是依据外形和脊椎骨数量作为分类依据，但形态学方法受到发育阶段的限制，因此采用形态学鉴定鳗鲡苗种的方法存在较多缺陷[14]。最近，利用分子手段鉴定鳗鲡苗种的方法受到广泛关注和认可，线粒体COI[15]，16S rRNA[16]，以及 RAPD[17]等遗传标记均能有效地鉴别鳗苗的种类，但基于线粒体D-loop序列鉴定鳗苗的研究尚未见诸多报道。之前，已有一些学者报道花鳗鲡D-loop遗传变异与系统地理关系[7-9]。本研究首次利用分子方法鉴定瓯江口6个采样点的玻璃幼鳗，并通过GenBank Blast发现这些幼鳗的种类为日本鳗鲡。瓯江口曾经是国家二级保护动物花鳗鲡的栖息地之一，近年的资源调查中发现该种类已基本绝迹，但仍有日本鳗鲡的踪迹[18]。本研究与先前研究得出的结论基本一致。

图3 幼鳗核苷酸错配分布曲线(预期模型：种群恒定)Fig.3 The nucleotide mismatch distribution curve in the eel larvae(expected null model：constant population size)

单倍型数目、单倍型多态性和核苷酸多态性是基于DNA序列遗传多样性研究的几个重要参数。本研究发现瓯江口34尾日本鳗鲡分别为34个不同的单倍型。单倍型多态性(Hd)为1.0，核苷酸多态性(π)为0.011，这说明该瓯江口幼鳗地理群体内的遗传变异水平较高。

各采样点之间没有显著的遗传差异 (FST≤0.023；P＞0.05)，AMOVA结果显示种群间的遗传变异率非常小，这说明瓯江口的日本幼鳗未形成地理分化，暗示它们可能随机地来自于同一个或多个产卵场。

此外，Tajima’s D显著性的负值(D=-1.982 96，P＜0.01)，表示日本鳗鲡种群在近期历史上可能曾出现过种群扩张事件。核苷酸错配分布结果进一步印证了这些日本鳗鲡可能发生过种群爆发性扩张。这一发现与先前的研究报道相吻合[19]，中国东部沿海多数Hd较高、π较低的鱼类，在末次冰期以来都有过一次规模较大的种群扩张。