特发性矮小患儿IGFBP-3 mRNA表达及基因外显子突变的研究

李　静,杨晓丽,高爱梅

(山西省人民医院儿科,太原　030012;*通讯作者,E-mail:yangxlsx1989@163.com)

特发性矮小(idiopathic short stature,ISS)是一种暂时尚无明确原因的矮身材,其发病机制尚未完全阐明。身高的线性增长受营养代谢轴和下丘脑生长激素-胰岛素样生长因子-1(GH-IGF-1)轴的调节,其中GH-IGF-1轴是调节儿童生长发育中最重要的内分泌通路[1]。研究显示,生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)、矮小同源盒(short stature homeobox containing,SHOX)、胰岛素样生长因子-1受体(IGF-1 receptor,IGF-1R)基因与中国ISS发生有关,且不同基因型与ISS患儿的生长激素疗效有关[2]。胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor 1,IGF-1)直接作用于靶器官介导生长激素促生长效应,胰岛素样生长因子结合蛋白3(insulin like growth factor binding protein 3,IGFBP-3)是IGF-1的主要载体,IGFBP-3与IGF-1结合后,延长IGF-1半衰期[3],从而促进身高的生长。目前国内外对IGFBP-3基因表达异常与ISS身高增长关系的研究较少。本文通过对血清中IGFBP-3 mRNA表达量及IGFBP-3基因突变的检测,了解IGFBP-3基因与ISS发生的关系。

1　资料与方法

1.1　临床资料

选取2012-05～2014-10来山西省人民医院儿科就诊的26例4-14岁ISS患者为研究对象。其中男14例,女12例,另选取10例同时期来我院就诊的生长发育正常的健康儿童为对照组。两组患者年龄、性别差异比较无统计学意义,具有可比性。

入选特发性矮小标准:①身高低于同性别、同年龄正常参考值平均数减2个标准差;②两项标准GH激发试验的GH峰值≥10 ng/ml;③出生时身长和体质量正常,而且身材匀称;④无明显的慢性器质性疾病(肝肾心肺内分泌代谢病和骨骼发育障碍);⑤无心理和严重的情感障碍,摄食正常;⑥染色体检查正常;⑦骨龄正常或延迟。

对所有受检者及对照组儿童进行详细的体格检查,测量身高、体质量,计算BMI值,计算身高差,空腹用肝素抗凝管抽取静脉血5 ml,离心弃上清,存放于-80 ℃冰箱保存。

1.2　血清IGFBP-3 mRNA的表达量

1.2.1引物设计引物序列如下:IGFBP-3-F,GAGTCCAAGCGGGAGACAGAA;IGFBP-3-R,GAGGCTGCCCATACTTATCCACA,引物来源为IGFBP-3 NM-001013398.1[4]。由primer premier 5.0软件设计,引物的设计和合成均由英潍捷基公司完成。

1.2.2总RNA提取及逆转录所有受检者就诊时空腹用肝素抗凝管抽取静脉血5 ml,离心弃上清,存放于-80 ℃冰箱保存。实验时从-80 ℃冰箱拿出细胞沉淀后解冻,按试剂盒说明书提取全血RNA,使用分光光度计测定提取RNA的浓度和纯度。接下来使用RNA逆转录试剂盒表达的RR047A进行逆转录,完成后将得到的产物在-20 ℃条件下保存备用。

1.2.3实时荧光定量PCR检测IGFBP-3 mRNA利用被SYBR荧光标记的RT-PCR试剂盒测定IGFBP-3的Ct值,按照Ct值计算IGFBP-3的表达情况(按2-ddCt法进行标准化,计算相对表达量,ddCt=dCt实验样本-dCt校准样本,dCt=Ct目的基因-Ct内参基因)。

1.3　克隆测序检测IGFBP-3基因外显子

1.3.1引物设计引物序列IGFBP-3-F: GCTGACTCT- GCTGCTGCT,IGFBP-3-R:TAGCAGTGCACGTCCTC-CTT,引物来源为IGFBP-3 NM-001013398.1。由primer premier 5.0软件设计。

1.3.2总RNA提取及逆转录按上述方法提取血液中总RNA,使用RNA逆转录试剂盒表达的RR047A进行逆转录。

1.3.3PCR扩增将逆转录的DNA产物进行常规PCR扩增,PCR反应总体积50 μl(Template 5 μl,Forward Primer(10 μmol/L)1 μl,Reverse Primer(10 μmol/L)1 μl,10×EasyTaq Buffer 5 μl,2.5 mmol/L dNTPs 4 μl,EasyTaq DNA Polymerase 5 μl,ddH2O 33.5 μl),含TaqDNA聚合酶0.5 μl、10×反应缓冲液,PCR反应条件:94 ℃ 2-5 min;94 ℃ 30 s,50-60 ℃ 30 s,72 ℃ 1-2 kb/min,进行32个循环;72 ℃ 5-10 min。PCR产物进行琼脂糖电泳,凝胶成像系统检测条带。将电泳检测有目的条带的PCR产物送至赛默飞公司进行测序检测IGFBP-3基因外显子。

1.4　统计学分析

2　结果

2.1　IGFBP-3 mRNA的表达与各项指标的相关性

ISS组和对照组IGFBP-3 mRNA的表达量差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。对ISS组血清中IGFBP-3 mRNA的表达量和年龄、性别、身高差、BMI进行双变量相关分析,其中IGFBP-3 mRNA的表达量与年龄呈正相关(r=0.723,P=0.000),与性别、身高差及BMI无相关性(见表2)。

组别nIGFBP-3mRNAtP 对照组100.72±0.231.9180.060 ISS组260.88±0.43

表2IGFBP-3mRNA表达量和各临床指标的相关性分析

Table2CorrelationanalysisbetweentheexpressionofIGFBP-3mRNAandeachindex

临床指标IGFBP-3mRNArP 身高差0.0330.817 年龄0.7230.000 性别0.0690.626 BMI0.1480.294

2.2　IGFBP-3基因外显子测序

在26例ISS患儿中均未检测到IGFBP-3基因外显子突变，典型测序见图1。

图1　IGFBP-3基因外显子无突变Figure 1　No mutation of IGFBP-3 gene exon in a ISS child

3　讨论

身高的线性增长受营养代谢轴和下丘脑GH-IGF的调节。其中GH-IGF轴被认为是影响生长发育最重要的内分泌通路,该轴在任何水平出现异常都有可能导致矮小的发生,IGF-1直接作用于靶器官介导GH促生长效应,IGFBP-3通过以下途径作用于IGF-1,从而调节生长发育:①IGFBP-3具有刺激IGF-1对骨的生长作用[5];②IGFBP-3与IGF-1及IGF-2直接结合,可以延长IGF-1及IGF-2的半衰期,从而增加IGF系统促进细胞生长及分化的作用[6];③IGFBP-3可以与IGF-lR竞争结合IGF-1及IGF-2,抑制IGF系统介导的促进细胞生长及分化的作用。因此,IGFBP-3对IGF系统促进生长起双向调节作用。对青春期前ISS儿童测定血浆总IGF-l、游离IGF-1及IGFBP水平,结果显示血浆总IGF-l和游离IGF-1水平均低于对照组,相反IGFBP水平却明显升高[7],推测IGFBP-3增高使IGF-1降低是导致某些青春期前ISS儿童生长障碍的原因。此外,IGFBP-3除了对IGF-1生物利用度的影响,它还有其固有的抗增殖和促进凋亡活性的作用,IGFBP-3可以不依赖于IGF系统,直接被P53活化,通过P53途径发挥促进细胞生长的作用[8]。

IGFBP-3基因位于7p12-p13区域,共16 028 bp(NG-011508),包含5个外显子和4个内含子,剪切修饰后的mRNA长2.4 kb,编码264个氨基酸。该基因在物种间具有高度的保守性,双生子研究表明[9]:外周循环中的IGFBP-3水平大约一半以上是由遗传决定的,但具体的决定因素尚不很清楚。IGFBP-3基因启动子区的多态性可改变IGFBP-3和IGF-1的表达水平,进而影响多种疾病的发生、发展[8]。

国内外对特发性矮小患儿IGFBP-3基因与生长之间关系的研究报道较少,目前对IGFBP-3基因的研究主要集中在对牛、羊等动物的IGFBP-3基因多态性的研究上。高雪等[10]采用PCR-SSCP技术分析了牛IGFBP-3基因在南阳牛、鲁西牛和中国西门塔尔牛3个牛品种中的遗传多态性,序列分析结果发现位于IGFBP-3基因第8 069 bp处发生单碱基突变T/C,并导致了苯丙氨酸变为亮氨酸,并且与某些性状相关。人与动物之间存在同源性,因此我们推测人体中的IGFBP-3基因突变可能同样影响了某些蛋白的表达,进而影响身高。IGFBP-3基因突变可能和特发性矮小的发生有关。

目前有研究发现,在人的IGFBP-3基因启动子区域的-667G/A和-396C/T的多态性对基因转录或许有影响。-396C/T多态性增加了IGFBP-3基因启动子的转录活性。-396 C/T多态性和小于胎龄儿(small for gestational age infant,SGA)儿童的低出生体质量有关,低或高水平的IGFBP-3都会影响身高,低水平的IGFBP-3会影响IGFs的活性,但是当血清IGFBP-3增高后,它的抗增殖和促凋亡作用似乎更明显[11]。

本研究中,IGFBP-3 mRNA的表达和年龄呈正相关,说明IGFBP-3 mRNA表达量随着生长发育逐渐增多,这一点和IGFBP-3蛋白与年龄的关系是一致的。IGFBP-3 mRNA的表达量在ISS组和正常对照组中无差异,IGFBP-3 mRNA的表达和身高差、性别、BMI均无相关性,说明IGFBP-3 mRNA表达异常不是本组特发性矮小患儿的致病原因。本研究中用PCR-克隆测序的方法检测了IGFBP-3基因5个外显子,在26例ISS患儿中均无检测到IGFBP-3外显子基因突变,该结果与Guillaume等[12]的研究一致,他们对6 075个受试者进行研究,检测GH/IGF-1轴上基因多态性和身高的关系,没有发现IGFBP-3基因多态性,也进一步说明IGFBP-3基因多态性和特发性矮小患儿身高之间的关系不大。由此推测,IGFBP-3基因突变可能不是本地区ISS患儿的突变特点,也可能和实验样本量少、种族等有关,有待进一步研究。

参考文献：

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[10]高雪,徐秀容,许尚忠,等.牛类胰岛素生长因子结合蛋白3基因PCR-SSCP分析[J].农业生物技术学报,2006,14(4):474-477.

[11]Faienza MF, Marzano F, Ventura AM,etal. Regulation of IGFBP3 gene expression in short children born small for gestational age[J]. Growth Horm IGF Res, 2011,21(6):349-355.

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