自花授粉在安徽羽叶报春花色选育中应用的初步研究

刘　金　夏齐平　王　建　李　真　邵剑文,2*

(1.安徽师范大学生命科学学院，芜湖　241000； 2.安徽省重要生物资源保护与利用研究重点实验室，芜湖　241000)

在育种过程中，尽管自花授粉可能会因为不利基因的纯合易导致自交衰退，但由于自花授粉在确定基因型、获得隐性性状及纯合品系方面具有重要的作用，并且能使部分优良性状更加突出和稳定，因此，自花授粉已在园艺植物、农作物、果树的育种中得到较广泛的应用[1～4]。

安徽羽叶报春(PrimulamerrillianaSchltr.)现仅分布在我国安徽省南部丘陵山区，该植物具10～30枚簇生的羽状复叶，花期长(3～5月)，花朵多且显著，花淡粉白色至深红色，具较高的园艺开发价值。而且该物种分布对海拔要求不高(50～1 000 m)，可栽培驯化的潜力大。安徽羽叶报春与绝大多数报春花属(Primula)植物相似，具典型的两型花(即长柱花：柱头位于花冠筒口，而雄蕊花粉囊位于花冠筒中部；短柱花：柱头位于花冠筒中部，而雄蕊花粉囊位于花冠筒口)。这种二型花柱常常伴随有自花授粉、相同类型花授粉不亲和的生理障碍，即有效传粉仅局限于两种花型间(即正配授粉)，如长柱花花粉授给短柱花柱头或短柱花花粉授给长柱花柱头才能正常结籽[5～9]。但前期的授粉实验表明，安徽羽叶报春自花授粉具有一定的亲和性，自花授粉也能产生种子[10～11]。

花色是像安徽羽叶报春这类草本植物最重要的园艺性状之一，因此本文拟对自花授粉在安徽羽叶报春花色选育中应用的可能性进行研究，主要回答以下两个问题：与正配授粉相比，安徽羽叶报春自花授粉结籽效率及种子的萌发效率如何？自花授粉能否促进对其花色的选育？这些研究结果将为该濒危花卉的人工育种和花色的选育提供参考。

1　材料与方法

1.1　材料

供试材料采自安徽省太平县郭村乡(30°06′32.54″N,117°54′17.44″E)，2013年5月份收集成熟但未散裂的果实约20个，种子保存参照《一种草本植物种子的保存方法》(专利)[12]，种子萌发参照国标NY/T 1656.5-2008进行，萌发后幼苗选用口径20 cm，深10 cm的塑料花盆，用中性自配腐殖土盆栽，定植3株/盆，供试共155株。

1.2　人工授粉及种子收集

自花授粉：分别对长柱花和短柱花进行人工授自花花粉；正配授粉：人工授异型花花粉，即长柱花花粉授给短柱花柱头或短柱花花粉授给长柱花柱头。授粉均选择盛开的花朵进行，每种授粉长、短柱花各做300朵以上，观察座果状况，并于蒴果开裂前收集，于解剖镜下统计饱满种子数。

1.3　萌发率的统计

根据国标NY/T 1656.5-2008，8月末进行种子萌发实验。自花与异花授粉各取16个培养皿，长柱花与短柱花各取8个，100粒/皿。10天后统计第1次，后每隔5天统计1次，30天后每天统计1次，直至连续5天无种子萌发视为萌发结束。按下述公式计算萌发率与萌发势：

萌发率=萌发种子数/供试种子数

(1)

萌发势=20 d萌发种子数/供试种子数

(2)

1.4　花色的测量

对亲本群体每个植株各取1朵共155朵花冠在标准比色板的参照下进行扫描，花色分析通过photoshop软件读取R(红)、G(绿)、B(蓝)三色的值。以R值比重(即R值/三色总和)表示花冠的红色程度。在亲本群体中选取的30株(长短柱花型各15株)花较艳的植株(即R比值较高)进行正配和自花授粉，种子成熟开裂前收集种子，8月下旬进行萌发和定植，盛花期时每株各取1朵花进行花色分析，方法同前述。

1.5　数据处理及分析

用卡方检验分析两种授粉方式的座果率有无显著差异；用T检验分析两种授粉方式的结籽数、种子萌发率、种子萌发势有无显著差异；用单因素方差分析检验亲本群体、自花授粉子代、正配授粉子代的R值比重(通过PHOTOSHOP测量后计算)的差异。所有分析及R值比重频数分布图均在SPSS19.0中完成，其余图表均在EXCEL 2016中完成。

2　结果

2.1　座果率和结籽数

安徽羽叶报春自花授粉座果率为70.15±1.74%，显著小于正配授粉的座果率96.47±2.15%(x2=379.064，P<0.001)；两种花型不同的授粉处理座果率相似，差异不显著(P>0.05)(表1)。自花授粉结籽数可达36.03±1.86粒/果，正配授粉的结籽数为50.67±1.97粒/果，前者显著低于后者(t=29.421，P<0.001)。长柱花和短柱花的自花授粉及正配授粉的结籽数没有显著差异(P>0.05)(表2)。

2.2　萌发率和萌发势

安徽羽叶报春自花授种子粉萌发结束时间为33.37±1.88 d(均值±标准误，下同)，正配授粉种子萌发结束时间为34.57±1.89 d，两者差异不显著(t=0.889,P=0.322)。正配授粉种子萌发率为70.94±3.33%，显著高于自花授粉的种子萌发率41.13±3.05%(t=40.191，P<0.001)；在萌发势上，前者(51.38±3.04%)也显著高于后者(29.50±3.24%)(t=26.032，P<0.001)。两者萌发均在第15～25天比较集中，随后放缓直至停止萌发(图1)。在不同花型上，短柱花的正配授粉和自花授粉种子的萌发率(74.25±2.47%和51.00±2.21%)及萌发势(53.88±3.96%和39.63±2.56%)均显著高于长柱花的两种授粉的种子萌发率(67.63±2.64%和31.25±1.96%)及萌发势(48.88±2.71%和19.38±1.35%)，尤其是在自花授粉中表现的更为明显。

表1安徽羽叶报春自花与正配授粉坐果情况

Table1FruitsettingofselfandlegitimatepollinationinP.merrilliana

花型Flowertype授粉花朵数Numberofflowers坐果数Numberoffruits座果率Fruitsettingrate(%)自花授粉Selfpollination长柱花Pinflower65845268.69短柱花Thrumflower61544171.71总和Total127389370.15正配授粉Crosspollination长柱花Pinflower79276196.09短柱花Thrumflower79677196.86总和Total1588153296.47

表2安徽羽叶报春自花与正配授粉结籽数

Table2ThenumberofseedsofselfandlegitimatepollinationinP.merrilliana(mean±SE)

花型Flowertype自花授粉Selfpollination正配授粉Legitimatepollinationt长柱花Pinflower38.33±1.21(n=452)48.07±1.69(n=761)7.961**短柱花Thrumflower33.73±1.46(n=441)53.27±1.88(n=771)24.877***t0.7420.918

**P<0.01;***P<0.001

图1　安徽羽叶报春自花与正配授粉及不同花型的萌发速率Fig.1　The seeds germination speed of self and legitimate pollination and different flower types in P.merrilliana

图2　安徽羽叶报春亲本群体、自花与正配授粉子代R值比重Fig.2　R-specific rate of parental population,self and legitimate progeny populations in P.merrilliana

2.3　花色选育

安徽羽叶报亲本居群的花色R值比重均值为0.374±0.011(n=155)；花色较艳植株正配授粉子代花色R值比重均值为0.371±0.013(n=112)、自花授粉子代R值比重均值为0.382±0.014(n=139)，三者差异显著(F=4.285，P<0.05)，具体表现为自花授粉子代R值比重明显高于亲本群体和正配授粉子代，而后两者差异不显著(图2)。从R值比重的频数分布图来看，亲本群体与正配子代群体形态及峰值相似(0.375左右)，自花授粉子代R值比重频数分布图与前两者相似，但峰值明显右移(在0.382左右)，即花色红色成份明显增高。3个群体在两种花型上R值比重无显著差异(P>0.05)。

3　讨论

报春花属(Primula)全世界约有500种，多数具有重要的观赏价值而倍受园艺学家们的青睐，现已被列于世界三大园林植物[7,13]。该属约90%的物种具有典型的二型花，常伴有严格的自交和同型花授粉不亲和的生理障碍，有效传粉仅限于异型花间[7～9]。因此报春花属的遗传育种多采用正配授粉(即异型花间授粉)，自花授粉在报春花育种中很少使用[14]。但考虑到自花授粉在基因型的确定、隐性性状及纯合品系的获得方面具有重要的作用，因此本文尝试对安徽羽叶报春自花授粉在育种中应用的可能性进行研究。结果显示安徽羽叶报春虽与绝大多数报春花属植物一样为两型花，但它自交亲和程度较高，自花授粉的平均结籽数可达36.03粒/果，虽明显低于正配授粉的结籽数(50.69粒/果)，但也能达到正配授粉平均结籽数的71.11%，而且其萌发率也较高(为41.13%)，可达到正配授粉种子萌发率的57.98%。其自花授粉的结籽数明显高于同属的其它物种[7,9,15～16]。再加上安徽羽叶报春自花授粉单株可座果15～30个，按平均结籽数36粒/果、种子萌发率41%计算，单株自花授粉可获得种子约300～900粒，幼苗可超过100株，因此应能满足育种的需要。

二型花柱不仅表现在花朵雌雄蕊位置互补，在花粉大小和数目、柱头的形态也有明显的差别[5～6,17～18]。已有的研究还显示，在自交亲和性程度上长短柱花也有一定的区别，多数表现为长柱花的自交亲和性程度要高于短柱花的[7,19]。而本文的研究结果显示安徽羽叶报春长短柱花的自花授粉、正配授粉座果率和结籽数没有显著的差异(表1～2)，但是种子的萌发率和萌发势上，无论是正配授粉还是自花授粉，短柱花的均明显优于长柱花，尤其是自花授粉的种子表现的更为明显，即长柱花比短柱花自交衰退更明显，具体原因尚不清楚。

图3　亲本群体、正配授粉和自花授粉子代R值比重频数分布图　A.亲本群体；B.正配授粉子代；C.自花授粉子代Fig.3　The frequency distribution diagrams of R-specific rate for parental population,self and legitimate pollination progeny in P.merrilliana　A.Parental generation；B.Legitimate progeny；C.Self pollination progeny

花色是观赏植物最重要的品质性状之一，花色的遗传是一个极为复杂的问题，不同的物种可能差异较大，即有单基因控制的，也有的是多基因控制的数量性状，此外环境条件也可能对花色影响较大[20～21]。野外观察发现安徽羽叶报春花色各居群变化较大，总体来看有的居群花色较淡(如黄山温泉居群为淡粉红色)，而有的居群花色较艳，为粉红色至淡紫红色(如太平郭村乡附近的居群)，而且实验室栽培后花色与原居群相似(另文发表)，同一植株不同花朵花色较一致，说明其花色具有稳定的遗传特性。但居群内不同植株间花色有一定的变异，表现出明显的连续性，如本文实验的郭村乡附近居群经栽培后其红色成份R值比重均值为0.375，其频数分布图也呈明显的正态分布(图3)，因此推测安徽羽叶报春花色应该是一个多基因控制的数量性状。本文实验结果进一步显示：选择花色较红(即R值较高)的植株进行正配授粉，其花色与预期的相似，发生了明显的分离，其子代花色频数分布图与亲本几乎一致(图3，峰值也在0.375左右)，因此选择花色较艳的植株进行正配授粉很难达到花色的选育目的；而选取花色较艳植株进行自花授粉，其子代花色R值的均值显著高于亲本R值的均值，其花色R值比重频数分布图也明显右偏(即花色更红)，峰值在0.382左右，因此选取花色较艳植株进行自花授粉对花色具有明显的选育作用。

综上所述，安徽羽叶报春虽具两型花，由于自交亲和性较高，虽存在一定自交衰退现象，但单株仍可获得上百株的幼苗，而且在花红色的选育上较正配授粉表现出了明显的优势，再加它还有利于基因型的确定、隐性性状及纯合品系获得，因此建议自花授粉在安徽羽叶报春优良性状的选育，尤其是花色选育的过程中应加以重视和利用。

1.陈迪新,张绍铃.梨不同花龄自花与异花授粉的花柱内花粉管生长及坐果率的比较[J].果树学报,2007,24(5):575-579.

Chen D X,Zhang S L.Comparison of pear pollen tube growth in style and fruit set after self-and cross-pollination in different floral development stage[J].Journal of Fruit Science,2007,24(5):575-579.

2.乔治军.浅谈玉米种质创新及自交系选育途径[J].山西农业科学,2005,33(3):29-31.

Qiao Z J.Elementary introduction on creation of maize germplasm and selection method of self-bred lines[J].Journal of Shanxi Agricultural Sciences,2005,33(3):29-31.

3.马之胜,贾云云,王越辉,等.自交在桃树育种及种质资源研究中的应用[J].江西农业学报,2010,22(6):86-87.

Ma Z S,Jia Y Y,Wang Y H,et al.Application of selfing in peach breeding and germplasm resources research[J].Acta Agriculturae Jiangxi,2010,22(6):86-87.

4.王振忠,蔡邦平,陈登雄,等.鹤望兰的自花与异花授粉研究[J].北京林业大学学报,2001,23(2):32-35.

Wang Z Z,Cai B P,Chen D X,et al.Self pollination and cross pollination inStrelitziareginaeBanks[J].Journal of Beijing Forestry University,2001,23(2):32-35.

5.Darwin C.On the two forms,or dimorphic condition,in the species ofPrimula,and on their remarkable sexual relations[J].Botanical Journal of the Linnean Society,1862,6(22):77-96.

6.Van Rossum F,De Sousa S C,Triest L.Morph-specific differences in reproductive success in the distylousPrimulaverisin a context of habitat fragmentation[J].Acta Oecologica,2006,30(3):426-433.

7.Richards A J.Primula[M].2nd ed.Portland:Timber Press,2003.

8.Wedderburn F,Richards A J.Variation in within-morph incompatibility inhibition sites in heteromorphicPrimulaL.[J].New Phytologist,1990,116(1):149-162.

9.张长芹,朱惠芬,吴之坤.五种野生观赏报春花引种驯化初报[J].云南植物研究,2003,25(2):216-222.

Zhang C Q,Zhu H F,Wu Z K.A preliminary report on acclimatization of five wild ornamental primroses[J].Acta Botanica Yunnanica,2003,25(2):216-222.

10.邵剑文,张文娟,张小平.濒危植物安徽羽叶报春两种花型的繁育特性及其适应进化[J].生态学报,2011,31(21):6410-6419.

Shao J W,Zhang W J,Zhang X P.Reproductive characteristics and adaptive evolution of pin and thrum flowers in endangered species,Primulamerrilliana[J].Acta Ecologica Sinica,2011,31(21):6410-6419.

11.Shao J W,Wu Y F,Kan X Z,et al.Reappraisal ofPrimularanunculoides(Primulaceae),an endangered species endemic to China,based on morphological,molecular genetic and reproductive characters[J].Botanical Journal of the Linnean Society,2012,169(2):338-349.

12.安徽师范大学.一种草本植物种子的保存方法:中国,201210448343.5[P/OL].(2012-11-12)[2016-08-03].http://www.pss-system.gov.cn/sipopublicsearch/patentsearch/showViewList-jumpToView.shtml.http//www.pss-system.gov.cn/sipopublicsearch/patentsearch/searchHomeIndex-searchHomeIndex.shtml?params=4C3F74C3281B65A97F2870FF32DEFA0981140CB38CD-6885F14BD784B7AA473494F81882DFC088FDAE191C3-C26B622A55867FD3BE11BDD1EB7FB259D3EC30A824-B0F73CD742B72707E455F20BE7091188.

Anhui Normal University.Storage method of herbaceous plant seeds:CN,201210448343.5[P/OL].(2012-11-12)[2016-08-03].http://www.pss-system.gov.cn/sipopublicsearch/patentsearch/showViewList-jumpToView.shtml.http://www.pss-system.gov.cn/sipopublicsearch/patentsearch/searchHomeIndex-searchHomeIndex.shtml?params=4C3F74C3281B65A97F2870FF32DEFA0981-140CB38CD6885F14BD784B7AA473494F81882DFC088-FDAE191C3C26B622A55867FD3BE11BDD1EB7FB259D-3EC30A824B0F73CD742B72707E455F20BE7091188.

13.陈封怀,胡启明.Primulaceae[M].//陈封怀,胡启明.中国植物志:第59卷,第2分册.北京:科学出版社,1990:1-277.

Chen F H,Hu Q M.Primulaceae[M].//Chen F H,Hu Q M.Flora Reipublicae Popularis Sinicae:Vol.52(2).Beijing:Science Press,1990:1-277.

14.Karlsson M G.Primulaculture and production[J].Horttechnology,2001,11(4):627-635.

15.解玮佳,李世峰,龙德花,等.不同柱型杂交组合对欧报春坐果的影响初探[J].北方园艺,2010(21):59-60.

Xie W J,Li S F,Long D H,et al.Study on the influence of pin-thrum cross combinations on fruit-setting ofPrimulaacaulis[J].Northern Horticulture,2010(21):59-60.

16.周蕴薇,申丽丽,王晓丽,等.翠南报春传粉生物学研究[J].园艺学报,2011,38(3):519-526.

Zhou Y W,Shen L L,Wang X L,et al.The pollination biology ofPrimulasieboldii[J].Acta Horticulturae Sinica,2011,38(3):519-526.

17.Richards A J.Plant breeding systems:2nd ed[M].London and New York:Allen and Unwin,1997.

18.Webster M A,Gilmartin P M.Analysis of late stage flower development inPrimulavulgarisreveals novel differences in cell morphology and temporal aspects of floral heteromorphy[J].New Phytologist,2006,171(3):591-603.

19.Washitani I,Ishihama F,Matsumura C,et al.Conservation ecology ofPrimulasieboldii:Synthesis of information toward the prediction of the genetic/demographic fate of a population[J].Plant Species Biology,2005,20(1):3-15.

20.孙凡雅,沈向,束怀瑞,等.观赏海棠杂交育种花色早期定向选择研究[J].中国农业科学,2008,41(9):2748-2754.

Sun F Y,Shen X,Shu H R,et al.Early directional selection color of ornamental crabapples cultivars[J].Scientia Agricultura Sinica,2008,41(9):2748-2754.

21.何启谦.园林植物育种学[M].北京:中国林业出版社,1992.

He Q Q.Thremmatology of garden plant[M].Beijing:China Forestry Publishing House,1992.