越橘茎尖离体培养条件的研究

李艳霞　邓继峰　李桂君*

(1.黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨　150081； 2.沈阳农业大学林学院，沈阳　110866)

茎尖组织培养具有培养时间短，繁殖倍数高，不受季节影响的特点，已被广泛应用于农作物、果树、花卉等领域[1～3]。通过微茎尖培养直接诱导成苗，不仅可以获得无病毒植株，还可用于种质资源保存、遗传转化等多种研究[4～5]。

越橘(Vacciniumvitis-idaeaL.)是杜鹃花科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)多年生浆果类植物[6]。果实富含维生素、有机酸、糖类、微量元素和类黄酮等[7]，具有抗菌消炎、抗氧化、防癌、预防心血管疾病、改善视力和增强免疫力等作用[8]，是集营养、药用和经济价值为一体的经济林树种，近年来倍受人们的关注。

目前国外已经培育出了近百个越橘优良品种，且已形成了产业化。虽然我国对越橘的研究、开发和利用较晚，但在种质资源收集、引种栽培、繁殖等方面取得了一定进展。各类越橘的繁殖方法不同，但组织培养法更能适合越橘快速发展的需要[9]，在国外通过茎尖培养获得脱病毒苗，在生产上得到了广泛应用。国内有关越橘组织培养主要有，金彦磊等[10]和田新华[11]等对越橘叶片、子叶、胚轴、腋芽及茎段为外植体的组培快繁进行了研究。而对越橘微茎尖进行离体培养缺乏系统研究。因此，本研究以越橘为材料，旨在建立越橘茎尖离体培养及植株再生组培体系，为越橘无病毒苗繁育、种质资源保存以及商业化生产等奠定基础。

1　材料与方法

1.1　外植体消毒

剪取当年生越橘优树嫩梢，用自来水冲洗30 min。在超净工作台上，用75%的酒精溶液消毒30 s，无菌水冲洗2次，转到0.1%升汞溶液中灭菌5～8 min，再用无菌水冲洗5次，最后用无菌滤纸吸干表面水份备用。

1.2　培养基筛选试验

分别以MS、WPM、改良的WPM(用708 mg·L-1的Ca(NO3)2·4H2O、202 mg·L-1的KNO3代替WPM培养基中的CaCl2和K2SO4)为基本培养基，培养基中分别添加ZT 0.05 mg·L-1、GA30.1 mg·L-1和IBA 0.5 mg·L-1，蔗糖20 g·L-1，琼脂6 g·L-1，pH值5.4。在超净工作台上，于解剖镜下剥取带有1～2个叶原基的茎尖接种在以上培养基上，每瓶接种6个茎尖，每个处理接种5瓶，3次重复，共接种90个茎尖。进行暗培养一周后转入光培养，培养温度均为25±2℃，光照培养时光周期为14 h·d-1，光照强度为2 200 lx，以下实验条件均与此相同。2个月后统计成苗率及生长情况。

1.3　激素诱导试验

在超净工作台上，于解剖镜下剥取带有1～2个叶原基的茎尖迅速接种于改良的WPM培养基上，培养基中分别添加0.01、0.05、0.08、0.1 mg·L-1的ZT(反式玉米素)，添加0.1、0.5、1.0 mg·L-1的IBA，添加0.1 mg·L-1的GA3。

1.4　茎尖长度试验

分别剥取0.1～0.3、0.3～0.5、0.5～0.7和0.7～1.0 mm的茎尖迅速接种到WPM(改良)培养基上，培养基中分别添加ZT 0.05 mg·L-1、GA30.1 mg·L-1和IBA 0.5 mg·L-1。

1.5　增殖培养试验

将由小茎尖诱导的植株切成1～1.5 cm长的段，转接到增殖培养基上。增殖培养基以WPM(改良)培养基为基本培养基，附加0.1、0.2 mg·L-1的GA3，0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1的ZT一个月后统计增殖倍数及生长情况。

1.6　生根移栽

选取增殖继代培养2～3次的健壮试管苗在温室中炼苗，3～4 d后成簇取出(带有愈伤组织)，用清水冲洗基部，去除培养基。在浓度为500 mg·L-1的IBA中浸泡5 min，用消毒的水苔包裹苗，仅露出1/3～1/4顶部，栽到96孔的小营养钵诱导生根，用透光的塑料薄膜拱棚保温保湿，相对湿度控制在85%左右，温度控制在25℃，诱导生根，40 d调查生根率。移栽基质为草炭∶蛭石(体积比)=2∶1组成的基质。

1.7　数据统计分析

按下列方法统计茎尖离体培养成苗率以及增殖系数：

茎尖成苗率=(茎尖成活数/接种茎尖数)×100%

(1)

丛生芽增殖系数=诱导出丛生芽总数/诱导出丛生芽的外植体数

(2)

2　结果与分析

2.1　培养基种类对茎尖生长的影响

茎尖接种到3种培养基上后，成苗率有显著差异(表1)。接种到MS培养基上的茎尖诱导的苗生长较弱、淡黄。茎尖接种到改良的WPM培养基上比接种在MS以及WPM培养基上生长健壮，茎尖诱导成苗率达到84.5%，因此WPM(改良)培养基为茎尖诱导成苗的最佳培养基。

表1培养基类型对茎尖生长的影响

Table1TheeffectsofdifferentmediumtypesonV.vitis-idaeastemapexgrowth

处理Treatment培养基类型Mediumtype接种茎尖数(个)Inoculatedstemapexnumber成苗率Seedlingrate(%)生长情况Growingstates1MS6068.2b较弱、淡黄Weak,yellowish2WPM6076.4ab生长缓慢Poorgrowth3WPM(改良)WPM(Improved)6084.5a健壮Strong

注：同一列不同字母表示在P<0.05水平下差异显著性下同。

Note:The different letters at the same column are significant atP<0.05 level.The same as below.

2.2　激素对越橘茎尖诱导的影响

越橘茎尖接种到培养基后，10 d左右茎尖生长点开始转绿，2个月左右由茎尖诱导的芽长度可达0.8～1.0 cm，但不同培养基诱导茎尖生长情况各异。由表2～3可见，在茎尖诱导过程中，激素配比对茎尖诱导成苗率有显著影响。ZT浓度对茎尖分化有很大影响，随着ZT浓度的增高，茎尖诱导产生的簇状芽数量也随之增多；ZT浓度为0.1 mg·L-1以下时，茎尖诱导产生芽的数量随之减少，茎尖大多为单芽。在茎尖诱导过程中，IBA浓度对茎尖生长也有很大影响，IBA浓度达到1.0 mg·L-1时，茎尖生长受抑制，长势差。处理8能够诱导获得健壮的单芽成苗，成苗率为91.2%。处理13和14虽然成苗率也很高，而且可以诱导簇状芽，但幼芽不健壮。因此以处理8WPM(改良)+ZT 0.05 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+GA30.1 mg·L-1为越橘茎尖诱导最佳激素及浓度配比组合。

表2不同激素对越橘茎尖诱导的方差分析

Table2TheANOVAanalysisofdifferenthormoneonV.vitis-idaeastemapexinduced

处理Treatment平方和Thesumofsquare自由度Degreesoffreedom均方MeansquareFPr>PZT1078.1883359.3964.526*0.028IBA824.6842412.425.193*0.022ZT×IBA1246.0176207.952.618*0.0411误差Error1905.7242479.405

表3　不同激素对越橘茎尖诱导的影响

表4不同长度茎尖诱导分化成苗率

Table4Theseedlingrateofdifferentlengthofstemapexinduction

处理Treatment茎尖长度Thelengthofstemapex(mm)叶原基数(个)Leafprimordiumnumber成苗率Seedlingrate(%)成苗时间Seedlingtime(d)160.1～0.3128C60～68170.3～0.5268B55～60180.5～0.7279AB50～54190.7～1.0294A45～50

注：同一列不同字母表示在P<0.01水平下差异显著性。

Note:The different letters at the same column are significant atP<0.01 level.

2.3　茎尖长度对诱导成苗率的影响

由表4可见，茎尖的大小直接影响着诱导成苗率，茎尖越大成苗率越高，成苗时间越短。当越橘茎尖长度为0.1～0.3 mm时茎尖成苗率仅为28%，成苗时间需要60～68 d；茎尖长度达到0.3～0.5 mm时，茎尖成苗率为68%，成苗时间为55～60 d；茎尖长度达到0.5～0.7 mm时，茎尖成苗率为79%，成苗时间为50～54 d；当茎尖长度为0.7～1.0 mm时，茎尖成活率高达94%，成苗时间为45～50 d。

2.4　增殖培养

将越橘茎尖诱导培养的苗转接到增殖培养基上进行培养，一个月调查丛生芽增殖系数及生长情况。由表5可见，不同浓度的ZT和GA3对苗的增殖和高生长有显著影响。在增殖培养过程中，不定芽的增殖系数随着ZT浓度的升高呈先升高而后下降的趋势ZT浓度在0.5～1.5 mg·L-1范围内，ZT浓度为0.5 mg·L-1时，苗的增殖系数最低为2.2，随着ZT浓度升高，苗增殖系数增加；当ZT为2.0 mg·L-1时，苗的增殖降低为3.1倍；GA3浓度对苗的高生长有一定影响，当浓度达到0.1时苗健壮，当浓度达到0.2时越橘生长有抽长现象。综合增殖系数、苗高以及生长情况，处理21WPM(改良)+ZT 1.0 mg·L-1+GA30.1 mg·L-1为最佳增殖培养基，增殖系数为3.8倍，苗高为2.44 cm，生长健壮。

表5　激素对幼苗增殖的影响

2.5　生根与移栽

选取增殖继代培养2～3次的健壮试管苗，温室中炼苗3～4 d后成簇取出(带有愈伤组织)，用清水冲洗基部，去除培养基。在浓度为500 mg·L-1的IBA中浸泡5 min，用消毒的水苔包裹苗，仅露出1/3～1/4顶部，栽到96孔的小营养钵诱导生根，用透光的塑料薄膜拱棚保温保湿，相对湿度控制在85%左右，温度控制在25℃，诱导生根，40 d后生根率达76.2%，平均根长1.44 cm。苗木生根后连同水苔一起移栽到草炭∶蛭石(体积比)=2∶1组成的基质中，对湿度控制在65%左右，温度控制在25℃左右，移栽初期适当遮荫，防治阳光直射，以后逐渐增加日照时间和强度，同时注意通风，移栽成活率达85.9%。

3　讨论

植物激素是影响植物的关键因子之一，在组织培养中起重要作用，选择适宜的激素以及激素浓度极其关键[12～13]。Julia Meiners[14]等研究发现ZT对越橘的初始诱导以及增殖培养有主导作用。段祖安[15]等侧芽进入初代培养时，在0.5～2.0 mg·L-1范围内，ZT浓度越高侧芽生长越好。本研究通过对越橘茎尖诱导培养试验发现，ZT浓度低于0.1 mg·L-1有利于茎尖诱导形成单芽，ZT浓度达到0.5 mg·L-1时，有利于组织分化形成丛生芽。越橘茎尖接种在WPM(改良)+ZT 0.05 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+GA30.1 mg·L-1的培养基中可诱导产生健壮的芽。增殖培养阶段，ZT浓度在0.5～1.5 mg·L-1范围内，适当地提高其浓度，则有利于提高繁殖系数。当ZT浓度超过1.5 mg·L-1时，增殖系数降低，有效芽数量减少。越橘不同组培阶段所需激素浓度有一定差异，分析产生这种差异的原因，可能与外植体不同有很大因素。

茎尖大小是影响成苗率的重要因素，茎尖越大成苗率越高，相反茎尖越小成苗率越低[16]。进行越橘茎尖培养时，采用0.1～0.3 mm长的茎尖，成苗率28%；采用0.3～0.5 mm长的茎尖，成苗率能达到68%；茎尖长度达到0.5～0.7 mm时，茎尖成苗率为79%；当茎尖长度为0.7～1.0 mm时，茎尖成苗率高达94%。另外，越橘茎尖越小成苗时间越长，茎尖越大成苗时间越短，浦艳吉[13]对欧洲李和樱桃李茎尖的研究中也得到同样的结论。

与其他外植体如茎段、叶片等诱导相比，以微茎尖为外植体进行组织培养，可以减少污染，防止品种退化，由茎尖直接诱导成苗，还能够减少变异。另外，微茎尖培养还是脱毒技术的基础。利用越橘茎尖进行离体诱导、增殖及生根移栽是一套完整的技术，可为今后脱毒研究提供基础。

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