云芝发酵液中α-半乳糖苷酶酶学特性的研究*

杜　芳，雷　萍，吴亚召，张文隽，王贺祥

（1.陕西省微生物研究所，陕西 西安 710043；2.农业生物技术国家重点实验室，中国农业大学生物学院，北京 100193）

α-半乳糖苷酶 （α-galactosidase，EC 3.2.1.22）也称蜜二糖酶，是1种外切水解酶，可催化水解非还原性末端以α-1,6键结合的半乳糖苷化合物[1]，可用于水解豆科植物中α-半乳糖苷低聚糖，消除豆类制品中由此引起的抗营养因子，促进其他营养物质的消化和吸收，目前广泛应用于饲料业、食品业、医药工业等领域[2]。α-半乳糖苷酶大量分布于植物、微生物和动物中，由于来源不同其理化性质差异也较大[3]。因此，为保证获得高活性和高稳定性的α-半乳糖苷酶，需要研究一些外在因素对该酶的影响，如最适pH和最适反应温度等，并尽量提高酶活稳定性，确保后期应用到食品、饲料等领域中时可以稳定食用。本文研究云芝（Trametes versicolor） 发酵液中α-半乳糖苷酶的理化性质，并筛选提高其酶活稳定性的共溶剂，为该酶制剂的有效生产和应用提供理论依据。

1　材料和方法

1.1　菌种与试剂

云芝菌种来自于陕西省微生物研究所微生物资源中心第三研究室；底物对硝基苯基α-D-吡喃半乳糖苷（pNPG） 购自Sigma公司（N0877）；其它试剂均为分析纯。

1.2　培养基

斜面培养基：综合PDA；种子培养基：豆粨粉2%、KH2PO40.1%；发酵培养基：豆粨粉2%、半乳糖1%、MgSO40.1%、KH2PO40.05%。

1.3　云芝液体发酵

1.3.1液体种子培养

250mL三角瓶装入50mL液体种子培养基，加入10粒～15粒玻璃珠，高压灭菌后接入云芝斜面菌种，于26℃、180 r·min-1振荡培养5 d，获得云芝液体菌种。

1.3.2液体发酵培养

250mL三角瓶装入50 mL液体发酵培养基，高压灭菌后接入3%（v·v-1）的云芝液体菌种，于26℃、180 r·min-1振荡培养7 d，获得云芝发酵液。

1.4　α-半乳糖苷酶活性的测定

1.4.1粗酶液的制备

将云芝发酵液用高速冷冻离心机离心10 min得上清液，发酵菌丝球经研磨后低温抽提2 h，离心后得上清液，将2次离心获得的上清液合并即为粗酶液。

1.4.2酶活测定

吸取0.1mL适当稀释后的粗酶液，再加入浓度为10mmol·L-1的底物对硝基苯基α-D-吡喃半乳糖苷0.1 mL，于40℃恒温振荡反应10 min，加入0.8 mL的Na2CO3溶液振荡混匀，终止酶反应，于波长405 nm处测定吸光值。

酶活力单位定义：在一定条件下，每分钟生成1μmol对硝基苯酚的酶量为1个酶活力单位（U）[4]。

1.5　α-半乳糖苷酶理化性质的测定

1.5.1最适pH和pH稳定性的测定

最适pH的测定：配制不同pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH分别为2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0、8.0），测定α-半乳糖苷酶在不同pH缓冲液中的酶活，将酶活力最高值计为100%，计算各pH下的α-半乳糖苷酶相对酶活，并绘制酶活变化曲线。

pH稳定性的测定：将适当稀释的酶液与不同pH的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液在常温下孵育2 h，测定α-半乳糖苷酶活性，测得的最高酶活值计为100%，计算不同pH下的酶活存留率。

1.5.2最适反应温度和温度稳定性的测定

最适反应温度的测定：在不同温度20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃下反应，然后测定α-半乳糖苷酶活性，测得的最高酶活值计为100%，计算不同反应温度下α-半乳糖苷酶的相对酶活，并绘制酶活变化曲线。

温度稳定性的测定：将适当稀释的酶液分别在不同温度下孵育2 h，在最适反应温度下进行酶活性测定，以未保温（4℃）时测得的酶活值计为100%，计算不同反应温度下的酶活存留率。

1.5.3金属离子对α-半乳糖苷酶活性的影响

使用去离子水配制 20 mmol·L-1的 K+、Ca2+、Cu2+、Mg2+、Cd2+、Mn2+、Hg2+、Pb2+、Zn2+、Fe2+、Al3+和Fe3+金属离子溶液，再与α-半乳糖苷酶溶液混合，使各金属离子溶液终浓度分别达到1.25 mmol·L-1、2.5 mmol·L-1、5 mmol·L-1和 10 mmol·L-1，于 4℃下孵育2 h，然后测定酶活性，以去离子水与α-半乳糖苷酶溶液混合测得的酶活计为100%，计算各种金属离子溶液中α-半乳糖苷酶的相对酶活。

1.5.4不同保护剂对α-半乳糖苷酶的影响

以一定比例将不同类型的保护剂与α-半乳糖苷酶溶液混合，60℃水浴1 h，取出后立即冰浴，稀释一定倍数测定酶活力，以未保温（4℃）、未加保护剂测得的酶活值计为100%，计算不同保护剂下的酶活存留率。

2　结果与分析

2.1　pH对云芝α-半乳糖苷酶活性的影响

pH对云芝α-半乳糖苷酶活性的影响结果，见图1。

从图1A中可以看出，当缓冲液pH为3.0时α-半乳糖苷酶活性最高，以此计为100%；pH为2.0时α-半乳糖苷酶相对酶活性为60%，此时并未失活；随着缓冲液pH的不断升高，α-半乳糖苷酶活性持续降低，当缓冲液pH为7.0时，相对酶活降低为10%，pH8.0时几乎检测不到酶活。从图1B中可以看出，α-半乳糖苷酶溶液在缓冲液pH2.0～5.0范围内酶活存留率依然在80%以上，说明α-半乳糖苷酶极耐酸性。因此，云芝发酵液中α-半乳糖苷酶的最适pH为3.0，在酸性条件下酶活稳定性最好。

图1　云芝α-半乳糖苷酶pH的特性Fig.1　pH properties ofα-galactosidase from Trametes versicolor

2.2　温度对云芝α-半乳糖苷酶活性的影响

反应温度对云芝α-半乳糖苷酶活性的影响结果见图2。

图2　云芝α-半乳糖苷酶温度的特性Fig.2　Temperature properties ofα-galactosidase from Trametes versicolor

从图2C可以看出，随着反应温度的逐渐升高，α-半乳糖苷酶活性持续增加，在60℃时酶活达到最大值，以此计为100%；随着反应温度升至70℃时，α-半乳糖苷酶相对酶活降低为60%，当温度为80℃时蛋白质发生了变性，此时几乎检测不到酶活。

从图2D中可以看出，当温度低于50℃时α-半乳糖苷酶活性比较稳定，相对酶活在70%以上；随着温度的升高酶活性有降低的趋势，在60℃时酶活性迅速降至5%，反应温度为70℃时α-半乳糖苷酶已失去活性。因此，云芝发酵液中α-半乳糖苷酶的最适反应温度为60℃，而且在较大温度范围内酶活性依然保持稳定，说明该酶耐热性较好。

2.3　金属离子对云芝α-半乳糖苷酶活性的影响

不同浓度的不同种类金属离子对云芝α-半乳糖苷酶活性的影响结果见表1，以未加金属离子测得的酶活计为100%。

从表1中可以看出，Fe3+对酶活性的抑制作用最强，当离子浓度为10 mmol·L-1时几乎检测不到酶活，Fe3+浓度降低至1.25 mmol·L-1时酶活性才恢复到68%；Pb2+对酶活性的抑制作用也较强，当其浓度为10mmol·L-1时酶活性降低至13%，随着Pb2+浓度的逐渐减小，对酶活的抑制作用也随之降低；Cd2+、Cu2+、Hg2+对α-半乳糖苷酶活性也有一定的抑制作用，酶活性降低20%～50%，Ca2+、Mg2+、Zn2+和Fe2+等离子对α-半乳糖苷酶活性影响不明显。

2.4　不同保护剂对云芝α-半乳糖苷酶热稳定性影响

不同保护剂对云芝α-半乳糖苷酶活性的影响结果见表2。

表1　金属离子对α-半乳糖苷酶活性的影响Tab.1　Effect ofmetal ion onα-galactosidase

从表2中可以看出，除添加山梨酸钾不利于α-半乳糖苷酶的热稳定性以外，其它保护剂均对α-半乳糖苷酶热稳定性有较好的保护效果，酶活保留率均高于对照组（54.18%）；其中保护效果最好的是甘露醇，其次是海藻糖、蜜二糖、棉籽糖、L-半胱氨酸、甘油和黄原胶等。

从表2中还可以看出，同一种保护剂不同浓度对α-半乳糖苷酶热稳定性的保护作用也不同，添加浓度2 mmol·L-1的甘露醇、海藻糖、乳糖、抗坏血酸、棉籽糖、蜜二糖、L-半胱氨酸、CaCl2·2H2O、白蛋白、NaCl和明胶，酶活保留率高于添加浓度1 mmol·L-1；添加浓度 1mmol·L-1巯基乙醇效果好于添加浓度2 mmol·L-1，添加10%甘油酶活保留率高于20%，其次是0.2%黄原胶、0.3%黄原胶。

3　讨论

通过对云芝发酵液中α-半乳糖苷酶酶学性质的研究发现，α-半乳糖苷酶最适反应pH为3.0，并且极耐酸性，在pH2.0～5.0之间酶活性依然保持在80%以上；最适反应温度为60℃，在低于60℃条件下该酶稳定性良好，但是随着温度上升至60℃，酶活性骤然降低，说明随着温度的升高，蛋白质已经开始变性丧失活性，但是在很大温度范围内（20℃～70℃）酶活性依然保持稳定，说明该酶是1种耐热的α-半乳糖苷酶。

金属离子对云芝α-半乳糖苷酶的影响结果显示，Pb2+和Fe3+对其酶活性有较强的抑制作用，随着金属离子浓度的升高，抑制作用越来越明显，Cd2+、Cu2+、Hg2+致使α-半乳糖苷酶活性降低20%～50%，其他金属离子对该酶活性的抑制作用不明显。

表2　不同保护剂对α-半乳糖苷酶热稳定性的影响Tab.2　Effectof different protective agents on the thermostabilityofα-galactosidase

酶成品中常需要加入糖类、甘油、多元醇、氨基酸及其衍生物等共溶剂，以改变酶溶液的热力学性质，提高酶的稳定性，保存酶活[5]。本文研究发现在云芝α-半乳糖苷酶溶液中加入几种不同的共溶剂，对α-半乳糖苷酶热稳定性都有较好的保护效果，其中效果最好的是甘露醇，其次是海藻糖、蜜二糖、棉籽糖、L-半胱氨酸、甘油和黄原胶等；不同浓度保护剂对α-半乳糖苷酶热稳定性的保护作用不同，添加浓度2 mmol·L-1的甘露醇、海藻糖、乳糖、抗坏血酸、棉籽糖、蜜二糖、L-半胱氨酸、CaCl2·2H2O、白蛋白、NaCl和明胶，酶活保留率高于添加浓度 1 mmol·L-1；添加浓度 1 mmol·L-1巯基乙醇效果好于添加浓度2mmol·L-1，10%甘油酶活保留率高于20%，其次是0.2%黄原胶、0.3%黄原胶。保护云芝α-半乳糖苷酶稳定性的共溶剂的筛选，可为提高该酶生产和储存中酶活稳定性提供一定的应用价值。

参考文献：

[1]杨志强，师昆景，于锋.饲用α-半乳糖苷酶酶活稳定性的研究[J].饲料工业，2011，32（14）：26-29.

[2]杨冠东，刘芳，李荷.α-半乳糖苷酶的研究进展概况[J].现代食品科技，2006，22（3）：275-279.

[3]赵晴潇，魏群.产α-半乳糖苷酶菌株的筛选、酶学特性和固定化研究[J].东北电力大学学报，2015，35（3）：77-81.

[4]Rezessy-SzabóJM,Nguyen QD,Hoschke Á,et al.A novel thermostableα-galactosidase from the thermophilic fungusThermomyces lanuginosusCBS 395.62/b:Purification and characterization[J].Biochimica Et Biophysica Acta General Subjects,2007,1770(1):55-62.

[5]苏俊，张国政，刘忠华，等.蛋白质在分离纯化中保持稳定的方法及应用[J].天津轻工业学院学报，2002（1）：21-24.