变异冬红果无菌体系的建立

韦 晨，王 醒

(1.江苏大学，现代农业装备与技术教育部重点实验室，江苏镇江 212013；2.江苏艺轩园林景观工程有限公司，江苏镇江 212000)

冬红果(Malusspectabilis)是蔷薇科苹果属落叶灌木或小乔木，因其挂果期可延至第2年2—3月，故又名长寿果。冬红果喜阳光充足和凉爽干燥的环境，适宜在含腐殖质丰富、疏松肥沃、排水良好的沙质土壤中生长；植株较矮小，树型紧凑，花浅粉红色，伞房花序，春季开放；果实呈簇状，圆球形或扁圆形，秋季成熟，果色初为绿色，后转黄色，最后呈鲜红色，具有较高的观赏价值，是培育观果盆景的极佳树种[1-2]。江苏大学现代农业装备与技术教育部重点实验室在冬红果的栽培过程中发现1株变异冬红果，该变异株不仅叶片呈紫色，而且果实初期亦呈紫色，至深秋果色由紫入红，寓意万紫千红，前期的紫叶紫果既增添了色彩变化的多样性，满足了人们对观赏植物新、特、奇的要求，又在一定程度上使得观果期向前延伸，因此，具有这一特异性状的冬红果变异植株更具市场潜力。

采用传统的嫁接繁育技术不仅使变异冬红果优良性状难以保存，而且使繁殖效率较低，极大地限制了变异冬红果的优树选育和规模化扩繁。而组织培养繁殖方法，不仅可对变异母本的优良性状进行保持、提纯或复壮，而且离体培养下繁殖体个体小、群体大，且可控的环境还能消除季节因素的限制，从而显著地提高繁殖系数[3-4]。因此，组织培养繁殖方法在变异冬红果的繁殖方面优势明显。目前有关冬红果组织培养快繁技术的报道鲜见。而对苹果属植物组织培养进行消毒处理时，大多会选用75%乙醇和0.1%或0.05%氯化汞消毒，也有用0.1%氯化汞单独消毒，均能达到很好的消毒效果[5-8]。另外，为达到相同的消毒效果，通常随消毒剂浓度的降低，消毒时间逐渐延长。如在研究不同消毒方法对辣木外植体的影响时，结果表明氯化汞浓度越低，消毒时间越长，才与短时间高浓度的氯化汞溶液达到相似的消毒效果，否则，污染率相对较高[9]。但是，不同种类的苹果属植物组培时，无论是消毒剂种类及其浓度选择，还是消毒时间的确定，均存在一定差异，因此对于每一种苹果属植物均需通过一系列的筛选比较，优化出较为适宜的消毒方法。笔者以变异冬红果茎段为外植体，比较不同消毒剂浓度和消毒时间，研究其无菌体系的建立，以期为变异冬红果增殖和生根培养奠定基础。

1　材料与方法

1.1供试材料以采自江苏艺轩园林景观工程有限公司的1株变异冬红果新萌发的带芽茎段为外植体；消毒试剂为乙醇和氯化汞。

1.2试验方法

1.2.1外植体的处理与清洗。剪取变异冬红果新抽生的嫩枝，除去叶片，留取4 cm左右带腋芽的茎段，用洗衣粉水浸泡3～5 min，流水下冲洗30～60 min，冲洗干净后备用。

1.2.2外植体的消毒。乙醇(75%)、氯化汞(0.1%)配合使用进行消毒，消毒后用无菌水冲洗3～4次；使用氯化汞(0.1%)消毒 6、7、8、9 min，消毒后用无菌水冲洗3～4次；当消毒剂浓度降低时，为达到相同的消毒效果，需要相应地延长消毒时间，因此，使用氯化汞(0.05%)选取的消毒时间为10、15、20、25 min，消毒后用无菌水冲洗3～4次。

1.2.3接种。在超净工作台上将消毒过的外植体切成带腋芽长度为1～2 cm的茎段，将茎段接入芽诱导培养基中。每瓶接种1个茎段，每个处理接种30个带芽茎段，重复3次。

1.2.4培养条件。 培养温度为24～26 ℃，光照时间为10 h/d，光照强度为1 800～2 200 lx。

1.3统计方法培养7 d后统计污染情况；培养30 d后统计褐化死亡率和成活率。

污染率=污染的外植体数/接种的外植体数×100%

褐化死亡率=死亡褐化的外植体数/接种的外植体数×100%

成活率=成活的外植体数/接种的外植体数×100%

2　结果与分析

2.1乙醇与氯化汞不同时间配合处理对外植体的影响由表1可知，乙醇与氯化汞结合消毒对污染有一定的控制作用，但两者结合消毒，可能破坏了茎段的生长点，导致成活率不高。从污染率来看，随着0.1%氯化汞消毒时间的增加，污染率逐渐降低。从死亡率来看，随着消毒时间的增加，褐化死亡率也在逐渐增加。从成活率来看，75%乙醇和0.1%氯化汞作为消毒剂，随着0.1%氯化汞消毒时间的延长，成活率呈先上升，然后逐渐下降的趋势。当0.1%氯化汞消毒时间超过12 min后，成活率为0；当 0.1%氯化汞消毒时间为 10 min 时，成活率最高，但仅为 38.89%。因此，当乙醇与氯化汞结合消毒时，变异冬红果茎段较适宜的消毒方法为75%乙醇30 s+0.1%氯化汞10 min。

表1乙醇与氯化汞对变异冬红果茎段的消毒效果

Table1DisinfectioneffectofalcoholandmercuricchloridsonmutantMalusspectabilisstemsection%

组号GroupNo.处理方法Treatmentmethod污染率Contamin-ationrate褐化死亡率Browningmortality成活率Survivalrate175%乙醇30s+0.1%氯化汞7min33.3344.4422.22275%乙醇30s+0.1%氯化汞8min22.2250.0027.78375%乙醇30s+0.1%氯化汞9min16.6752.2231.11475%乙醇30s+0.1%氯化汞10min5.5655.5638.89575%乙醇30s+0.1%氯化汞11min4.4473.3322.22675%乙醇30s+0.1%氯化汞12min3.3396.670775%乙醇30s+0.1%氯化汞15min0100.000

2.2氯化汞(0.1%)不同消毒时间对外植体的影响由表2可知，从污染率来看，随着0.1%氯化汞消毒时间的延长，污染率逐渐降低。同时，从褐化死亡率来看，随着消毒时间的增加，虽然污染率降低了，但死亡率在逐渐增加。从成活率来看，随着0.1%氯化汞消毒时间的延长，成活率呈先上升，然后逐渐下降的趋势，当0.1%氯化汞消毒时间为 8 min 时，成活率最高，为50.00%，褐化死亡率为 20.00%。因此，用0.1%氯化汞消毒较为适合的消毒时间为8 min。

表2氯化汞(0.1%)对变异冬红果茎段的消毒效果

Table2Disinfectioneffectof0.1%mercuricchlorideonmutantMalusspectabilisstemsection%

组号GroupNo.处理方法Treatmentmethod污染率Contamin-ationrate褐化死亡率Browningmortality成活率Survivalrate10.1%氯化汞6min72.2211.1116.6720.1%氯化汞7min41.1116.6742.2230.1%氯化汞8min22.2220.0050.0040.1%氯化汞9min20.0038.8941.11

2.3氯化汞(0.05%)不同消毒时间对外植体的影响由表3可知，降低氯化汞的浓度并延长消毒时间，有效提高了变异冬红果茎段的成活率。随着0.05%氯化汞消毒时间的延长，污染率显著降低。从褐化死亡率来看，随着消毒时间的延长，褐化死亡率缓慢增长。从成活率来看，随着0.05%氯化汞消毒时间的延长，成活率整体较高，呈先升高再降低的趋势，当0.05%氯化汞消毒时间为 20 min 时，成活率最高，可达71.11%，褐化死亡率为11.11%。因此，用0.05%氯化汞消毒较为适合的消毒时间为20 min。

表3氯化汞(0.05%)对变异冬红果茎段的消毒效果

Table3Disinfectioneffectof0.05%mercuricchlorideonmutantMalusspectabilisstemsection%

组号GroupNo.处理方法Treatmentmethod污染率Contamin-ationrate褐化死亡率Browningmortality成活率Survivalrate10.05%氯化汞10min66.674.4428.8920.05%氯化汞15min35.566.6757.7830.05%氯化汞20min17.7811.1171.1140.05%氯化汞25min11.1133.3355.56

3　结论与讨论

通过以上研究可以发现，消毒剂和消毒时间的选择对变异冬红果茎段无菌体系的建立有很大的影响，通过3种消毒方式比较，结果表明最佳的消毒方式为0.05%氯化汞消毒20 min，污染率为17.78%，褐化死亡率为11.11%，成活率为71.11%；其次为0.1%氯化汞消毒8 min，污染率为22.22%，褐化死亡率为20.00%，成活率为50.00%；而75%乙醇30 s结合0.1%氯化汞10 min消毒，污染率为5.56%，褐化死亡率为55.56%，成活率为38.89%，效果最差。相比其他苹果属植物茎段的消毒处理，消毒方法和消毒时间仍有很大差异。垂丝海棠带芽嫩茎适宜用75%乙醇(20～30 s)和0.3%氯化汞(2～3 min)结合消毒[10]；木瓜海棠带芽嫩茎适宜用75%乙醇(30 s)和0.1%氯化汞(8～15 min)结合消毒[11]；来安花红水培外植体茎段适宜用70%乙醇(30 s)和0.1%氯化

汞(4 min)结合消毒，野外采集的外植体茎段适宜用70%乙醇(30 s)和0.1%氯化汞(7 min)结合消毒[12]；贴梗海棠带芽嫩茎适合用75%乙醇(45 s)和0.1%氯化汞(8 min)结合消毒[13]，也有研究表明贴梗海棠茎段适合用0.1%氯化汞(7～15 min)消毒[14]。由此可知，短时间和低浓度的氯化汞消毒更适合变异冬红果茎段，但氯化汞消毒时间过短，只能除去表面细菌，无法除去内源菌，而氯化汞浓度过高或消毒时间太长，则可能会对茎段组织细胞产生毒害作用，使细胞活性降低，甚至死亡[15]。因此，针对不同的苹果属植物，需要筛选不同的消毒剂和消毒时间，从而比较出较适宜的消毒方法。

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