不同生育期转Bt基因棉根系分泌物中氨基酸、有机酸等组分特征

赵悦 席瑞泽 付庆灵 朱俊 胡红青

摘要：通過水培抗虫棉及其亲本棉，研究不同生育期（幼苗期、苗期和花蕾期）棉花根系分泌的有机酸、氨基酸及Bt蛋白等分泌组成特征。结果表明，转Bt基因棉和常规棉根系分泌物的pH随生育期逐渐降低，由幼苗期的碱性（>8.0）转变为花蕾期的弱酸性（<6.8）；根系分泌物中水溶性碳、水溶性氮、Bt蛋白、有机酸、氨基酸及可溶性总糖随着生育期的延长显著上升。相同生育时期，两种棉花根系分泌物主要组成成分无差异，但是大多数组分（如水溶性碳、水溶性氮、可溶性总糖、氨基酸、有机酸等）的含量表现为常规棉>转Bt基因棉，且花蕾期差异最显著。甲酸为根系分泌物中有机酸的主要成分，在幼苗期、苗期和花蕾期，转Bt基因棉根分泌物中甲酸分别占有机酸含量的55%、75%、93%；常规棉根系分泌物中甲酸分别占有机酸含量的65%、39%、96%，因此，转Bt基因棉和常规棉甲酸含量差异是引起有机酸差异的主要原因。苏氨酸是根系分泌物中氨基酸的主要成分，在花蕾期，转Bt基因棉和常规棉根系分泌物中苏氨酸含量分别占总氨基酸的42%和36%。与转Bt基因棉相比，常规棉根系分泌物中含有更为丰富的碳、氮源物质。

关键词：转Bt基因棉；根系分泌物；Bt蛋白

中图分类号：S562 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）04-0026-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.04.007

Component Characteristics of Amino Acids and Organic Acids in Root Exudates from Transgenic Bt Cotton at Different Growth Stages

ZHAO Yue1，2，XI Rui-ze1，FU Qing-ling1，ZHU Jun1，HU Hong-qing1

（1.College of Resource and Environment，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；

2.CNSG Anhui Hong Sifang Co.，Ltd.，Hefei 230022，China）

Abstract： The component characteristics including organic acids， amino acids and Bt proteins of root exudates at different growth stages （seedling， seedling stage and bud stage） from transgenic Bt cotton and conventional cotton were studied. The results showed that the pH of transgenic Bt cotton and common cotton root exudates decreases gradually in the growth period， from the alkaline in seedling stage （>8.0） to the subacidity of the bud stage （<6.8）； The water-soluble carbon，water-soluble nitrogen， Bt proteins， organic acids， amino acids and total soluble sugar were increased significantly with the extension of growth period. At the same growth stages， there were no difference in main components of the two cotton root exudates， but the most root exudates component of conventional cotton（such as the water-soluble carbon， water-soluble nitrogen， total soluble sugars， amino acids， organic acids， etc.） were higher than those in Bt cotton， especially in the bud stage. As the main organic acid in the root exudates， formic acid in transgenic Bt cotton root exudates accounted for 55%， 75% and 93% at the young seedling， seedling and bud stages， respectively， and that in conventional cotton root exudates accounted for 65%， 39% and 96%， respectively. Therefore， the content of the formic acids was the main difference in the organic acids between the conventional and transgenic Bt cottons. As one of main amino acids in root exudates， threonine in the transgenic Bt cotton and conventional cotton at the bud stage accounted for 42% and 36%， respectively. Compared to the transgenic Bt cotton， the conventional cotton root exudates could provide more carbon and nitrogen resources for plant growth.

Key words： transgenic Bt cotton； root exudates； Bt proteins

大面积种植转Bt基因抗虫棉（又称转Bt基因棉、转Bt棉），在一定程度上降低了农药的使用，提高了棉花的产量和品质[1]，增加了经济效益。付庆灵等[2]研究发现，转Bt基因棉可释放Bt蛋白到土壤根际，推测转Bt基因抗虫棉根系分泌物中也可能存在Bt蛋白。李孝刚等[3]发现，由于外源基因的导入，转基因抗虫棉及常规棉之间根系分泌的氨基酸和糖类组成及含量存在显著差异，但未对根系分泌有机酸加以研究。冯洁等[4]分析检测了棉花根系分泌物中不同品种的氨基酸含量，差异最大的是丙氨酸，其余无显著性差异。根系分泌物以养分的形式进入土壤，加快了植物与土壤进行物质、能量与信息的交流[5]。因此，探明根系分泌物的特征有助于理解根际微生物相互作用机理。

本试验在无菌条件下收集转Bt基因棉及其亲本常规棉根系分泌物，鉴定其组成，对比转Bt基因棉和常规棉根分泌物成分的差异，为将来探索转Bt基因棉根系分泌物对土壤理化性质、酶活性和土壤微生物的多样性的影响提供依据[6]，为研究转Bt基因棉根分泌对生态环境安全问题奠定基础。

1 材料与方法

1.1 水培试验

转Bt基因棉及其亲本常规棉种子均由湖北省种子集团有限公司提供。将转Bt基因棉种及其亲本常规棉放入36 ℃烘箱（烘2 d）破除种子休眠，然后将种子在浓度为75%乙醇中处理30 s消毒，再用去离子水冲洗干净，将种子放入60 ℃温水中浸泡6～7 h后催芽处理（下层垫厚1 cm左右海绵，铺纱布-铺种子-盖纱布，纱布保持润湿即可）。待棉花芽长至3 cm时，用夹子将单层纱布固定在盒子周边，加满水，纱布上钻上小洞，将棉种芽放入洞中，使其进入液面吸水。当棉花三叶一心时，小心将作物幼苗取出，将根部冲洗干净，开始进行营养液培养。取出生长一致棉花幼苗移栽于盛满营养液的塑料水培箱（38 cm×56 cm×7 cm），温室里培养（光照14 h（6：00-20：00），温度为25～30 ℃），每隔7 d换一次营养液。营养液配方采用H.C.阿夫多宁水培配方[7]，含0.240 g/L NH4NO3、0.100 g/L Na2HPO4·12H2O、0.100 g/L NaH2PO4·H2O、0.360 g/L CaC12·2H2O、0.500 g/L MgSO4·7H2O和0.025 g/L Fe-EDTA，以及阿农营养液的微量元素。

1.2 作物根系分泌物的收集

在棉花幼苗期（19 d）、苗期（63 d）、花蕾期（138 d）收集根系分泌物，取20株大小一致的棉苗为一组，先用去离子水小心冲洗根部，然后放入加有400 mL去离子水的塑料烧杯内，根部遮光，每天收集5 h（10：00-15：00），收集液及时过滤带回实验室-20 ℃保存。将上述棉苗放回培养盒中。间隔1 d后继续如上条件收集，连续收集3次；合并收集液，于冷冻干燥机中浓缩至原体积的1/20，浓缩后0.4 mL浓缩液含1株棉花5 h的分泌量。将其收集在无菌的密闭容器中，-20 ℃保存，待测定分析。

1.3 根系分泌物的分析方法与数据处理

根系分泌物的基本性质采用土壤农化常规分析方法测定[8]，根系分泌物pH采用pH计测定；可溶性总糖采用蒽酮比色法测定；根分泌物Bt蛋白含量用ELISA法测定，所用酶联免疫试剂盒购自上海佑隆生物科技有限公司，ELISA检测根分泌物中的CrylAb、CrylAc晶体蛋白含量。操作步骤见试剂盒说明书。

有机酸的测定是将浓缩的根系分泌物分别过阳离子和阴离子树脂，最后用8 mL 2 mol/L HCl的交换阴离子树脂中吸收的有机阴离子。将HCl洗液冷冻浓缩冻干，并用1.5 mL去离子水溶解，过0.45 μm的滤膜后用HPLC（Agilent 1200，美国）测定有机酸含量。色谱柱为ZORBAX SB-Aq，（4.6 mm×150 mm，5 μm，美国），流动相为25 mmol/L磷酸二氫钾（pH 2.5）和甲醇（色谱纯）（V/V=98∶2）；柱温为25 ℃；进样体积为10 μL；流速为0.5 mL/min；检测波长为210 nm。样品中有机酸的定量分析采用外标法（标准曲线法）按峰面积计算。

氨基酸的测定采用L-8800全自动氨基酸分析仪（日本日立公司），氨基酸专用分析色谱柱46 mm×60 mm；检测波长440 nm和570 nm；柱温35 ℃；流速0.400 mL/min；柱后衍生试机流速0.350 mL/min；进样量20 μL。待测氨基酸有16种，分别是天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸。

用Excel进行数据的初步整理，SPSS 17.0软件对各指标进行方差分析和回归分析。数据作图采用Origin 8.0软件。

2 结果与分析

2.1 不同生育时期棉花根系分泌物pH的变化

从幼苗期到花蕾期，两种棉花根系分泌物的pH均由碱性向弱酸性转化（图1），这可能是由棉花根际分泌物的H+及有机酸等物质的增加引起的。相同生育时期，转Bt棉和常规棉pH无显著性差异。

2.2 不同生育期棉花根系分泌物中Bt蛋白含量的变化

如图2所示，转Bt棉根系分泌物幼苗期和苗期的Bt蛋白含量分别为30.1、28.7 ng/株，二者未达到显著性差异。常规棉根系分泌物幼苗期和苗期的Bt蛋白含量分别为24.5、21.0 ng/株，二者也未达到显著性差异。而在花蕾期，转Bt棉和常规棉根系分泌物中Bt蛋白分别为64.9、45.4 ng/株，与幼苗期、苗期Bt蛋白含量相比达到显著性差异，即本研究的3个生育时期，花蕾期根部分泌的Bt蛋白最多。比较相同生育期转Bt棉和常规棉根分泌Bt蛋白的含量，在幼苗期、苗期和花蕾期转Bt棉根系分泌物中Bt蛋白含量均大于常规棉，且达到显著性水平。

2.3 不同生育时期根系分泌物中水溶性碳、水溶性氮、水溶性碳氮比和可溶性总糖的变化

由图3可知，棉花根系分泌物中的水溶性碳含量随生育期的延长，均呈现增长的趋势。各生育期，转Bt棉和常规棉水溶性碳均有显著性差异，转Bt棉花蕾期的水溶性碳分别是幼苗期和苗期的8～43倍，常规棉花蕾期的水溶性碳分别是幼苗期和苗期的8～18倍。由此可知，花蕾期棉花根部将分泌大量的水溶性碳。

在根系分泌物中，幼苗期转Bt棉与常规棉水溶性碳含量无显著性差异，分别为0.27、0.28 mg/株；苗期转Bt棉水溶性碳含量为0.65 mg/株，常规棉水溶性碳含量为1.47 mg/株，差异达到显著水平；花蕾期常规棉水溶性碳含量为转Bt棉的2.4倍。可知，常规棉花蕾期根分泌水溶性碳远高于转Bt棉。

由图4可知，转Bt棉和常规棉根系分泌物中可溶性氮随生育期的延长呈递增的趋势，且各时期可溶性氮的含量呈显著性差异。特别是花蕾期，转Bt棉可溶性氮的含量分别是幼苗期和苗期的19倍和6倍；常规棉可溶性氮的含量分别是幼苗期和苗期的16倍和7倍。可知，随生育期的延长，根部可溶性氮的分泌也显著增加。在各个时期，常规棉根系分泌物中可溶性氮的含量大于转Bt棉，且呈显著差异。

图5为不同生育时期转Bt棉和常规棉根系分泌物中水溶性碳氮比的变化。各生育时期，转Bt棉根系分泌物中水溶性碳氮比在3～5，苗期的水溶性碳氮比最低。常规棉根系分泌物中水溶性碳氮比随生育期的延长呈现上升的趋势，且各生育期均达到显著性水平。比较常规棉和转Bt棉根系分泌物中水溶性碳氮比，在幼苗期，转Bt棉是常规棉的1.9倍，出现此变化主要原因可能是常规棉幼苗期水溶性碳的含量低引起的；苗期和花蕾期常规棉根系分泌物中水溶性碳氮比均大于转Bt棉。

由图6可知，从幼苗期到花蕾期，两种棉花根系分泌物中可溶性总糖呈现上升的趋势，且花蕾期远高于幼苗期和苗期。相同生育时期，轉Bt棉和常规棉在幼苗期可溶性总糖均较低，二者间差异不显著；在苗期和花蕾期，转Bt棉和常规棉根系分泌物中可溶性总糖含量均达到显著差异，常规棉在苗期和花蕾期根系分泌物中可溶性总糖分别是转Bt棉根系分泌物中的1.9、1.6倍。由此可知，与转Bt棉相比，常规棉可通过根部分泌更多的可溶性总糖。

2.4 不同生育时期根系分泌物中有机酸含量的变化

由表1可知，在3个不同的生育期，转Bt棉和常规棉根系分泌物中检测到7种有机酸。在幼苗期和苗期，常规棉根系分泌物中有机酸总量均高于转Bt棉；在花蕾期，两种棉花根系分泌物中有机酸含量迅速增加，主要是由花蕾期甲酸含量的增加引起的。在幼苗期、苗期和花蕾期转Bt棉根系分泌物中甲酸分别占有机酸总量的55%、75%、93%，而常规棉根系分泌物中甲酸分别占有机酸总量的65%、39%、96%。

在每个时期两种棉花根系分泌物中均含有草酸和甲酸。其中，甲酸是有机酸的主要成分，而乙酸只有在幼苗期转Bt棉根系分泌物中和常规棉苗期根分泌物中检测到。苹果酸和琥珀酸均在花蕾期根系分泌物中检测到，而酒石酸只在苗期根系分泌物中检测到。由此可知，转Bt棉和常规棉根系分泌物在不同的时期分泌的有机酸种类和含量均有较大的差异。

2.5 不同生育时期根系分泌物中氨基酸含量的变化

由表2可知，随着生育期的延长，氨基酸总量也随之增加，且每个时期中，常规棉根分泌物氨基酸的总量始终高于转Bt棉。共检测到16种氨基酸，苏氨酸是根系分泌物中氨基酸的主要成分，在幼苗期、苗期和花蕾期转Bt棉根系分泌物中苏氨酸分别占氨基酸总量的0.7%、26.0%、42.0%，而常规棉根系分泌物中苏氨酸分别占氨基酸总量的0.7%、18.0%、36.0%。在Bt幼苗期根系分泌物中未检测到半胱氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和精氨酸，而在苗期和花蕾期均检测到了这5种氨基酸，可知随着棉花生育期的增长，根部分泌的氨基酸种类也随之增加。由此可知，转Bt棉和常规棉根系分泌物在不同的时期分泌的氨基酸种类和含量均有较大的差异。

3 小结与讨论

本研究结果表明，转Bt棉和常规棉根系分泌物中的各组分（可溶性碳、可溶性氮、可溶性糖、Bt蛋白、氨基酸、有机酸等）的含量均有较大的差异。常规棉各生育期根系分泌物中水溶性碳、水溶性氮含量均高于转Bt棉。Grayston等[9]研究发现转基因植物改变了其根系分泌物和化学成分，遗传改良可能影响到植物分解速率和碳、氮含量，从而改变土壤环境[10]。与转Bt棉相比，常规棉根系分泌更多的碳、氮源物质。

棉花的各生育期内，转Bt棉根系分泌物中可溶性总糖含量均小于常规棉。已有研究发现抗病棉花根系分泌物中糖类物质种类差异较小，但常规棉根系分泌物中的各种可溶性糖含量均显著大于转Bt棉[11-14]。Wu等[15]、韩雪等[16]研究发现，作物的抗病性能随根系分泌物中的可溶性糖含量的下降而增加。可见，作物有抗病虫功能时会抑制作物根系可溶性糖的分泌。

大量研究证实，转Bt基因植物可通过植株残留和根系分泌释放Bt蛋白进入土壤。Saxena等[17]研究发现，转Bt玉米能通过根部渗出物释放Bt蛋白进入周围土壤，且保持了很强的杀虫活性。转Bt基因水稻可利用根系向土壤中释放Bt蛋白[18]。本研究发现，从幼苗期到花蕾期，转Bt基因棉和常规棉根系分泌物中均可检测到Bt蛋白的存在，但是转Bt棉的Bt蛋白显著高于常规棉，且在花蕾期Bt蛋白含量最高。

转Bt棉和常规棉根系分泌物中存在种类丰富的有机酸和氨基酸物质。在相同生育时期，各有机酸的含量有较大差异，而主要成分没有差异。其中根系分泌物中有机酸主要有草酸、甲酸、乙酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、琥珀酸，甲酸为主要有机酸，与Li等[19]的研究结果吻合。

本试验棉花根系分泌物中共检测到16种氨基酸，与前人的研究结果相近[20]。表明转Bt棉和常规棉根系分泌物中氨基酸含量多数会随着生育期的延长而增加，其中苏氨酸和丙氨酸是氨基酸的主要成分，常规棉根系分泌物中氨基酸的含量明显高于转Bt棉，且差异明显。Li等[21]研究发现转Bt棉和亲本常规棉根系分泌物中氨基酸含量存在显著性差异，与本研究结论一致。也有研究发现，常规棉根系分泌物中游离氨基酸的含量和种类都大于转Bt棉[13，14]。

根系分泌物中水溶性碳、水溶性氮、可溶性总糖、有机酸、氨基酸、铵态氮、硝态氮在3个生育时期均呈现递增的变化趋势，且同一生育时期常规棉根系分泌物中各组分的含量均大于转Bt棉，而转Bt棉根系分泌物中Bt蛋白大于常规棉。这可能是外源Bt基因导入后引起根系分泌物化学组成的改变[22]。转Bt抗虫棉由于外源基因的插入，引起受体棉花同工酶谱[23]和挥发性气味的化学成分改变，阎凤鸣等[24]、Grayston等[9]研究发现转基因植物改变了其根系分泌物和化学成分及其植物分解速率，遗传改良可能影响到植物分解速率和碳、氮水平，这些因素都可能是引起转Bt棉和常规棉根系分泌物差异的原因。

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