复方参术对TGEV感染仔猪小肠黏膜上皮细胞凋亡因子Bcl-2/Bax的影响

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(1.河南牧业经济学院，河南 郑州，450011；2.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特，010018)

引言

猪传染性胃肠炎是由传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种急性传染病[1]。猪感染后出现严重脱水、水样腹泻、剧烈呕吐等特征，尤以10日龄以内的仔猪更为严重，甚至可达100%死亡，给养猪业造成巨大经济损失。Jeong研究表明，感染TGEV的PK-15细胞，存在凋亡加速现象[2]，TGEV通过激活Bcl-2介导线粒体通路和FasL介导死亡受体通路，诱导PK-15细胞凋亡[3]。卫文强[4]等研究表明，黄芩、黄芪、大黄、金钱草体外对TGEV均有抑制作用。当前对于中兽药抗TGEV的研究主要集中在单味药或提取物单体进行体外抗TGEV感染和细胞的保护率上。现今成方中药制剂抗病毒作用研究太少，通过SIEC感染TGEV来探讨复方参术干预TGEV诱导SIEC凋亡的相关基因，为中药复方防治TGV提供理论参加。

1　材料与方法

1.1　材料

猪小肠粘膜上皮细胞(SIEC)，由西北农林科技大学张彦明教授实验室馈赠；PK-15与TGEV购于中科学院武汉病毒研究所;中药党参、茯苓、白术、扁豆、陈皮、等中药购于内蒙古万民药房连锁有限公司。

试剂

DMEM(gibco)，EGF(sigma)，HEPES(sigma)，EB(sigma)，AO(sigma),FBS(gibco)，ITS(gibco)，FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)，SuperSignalR West Femto Maximum Sensitivity Substrate(Thermo),0.25%胰蛋白酶(gibco)，一抗：Bcl-2(sc-492)、Bax(sc-493)均购于美国Santa Cruz生物试剂公司,HRP标记的兔抗山羊 IgG(联科生物),PVDF膜(Millipore),苦参碱(阿拉丁)。

仪器设备

二氧化碳培养箱(Thermo)，离心机(Eppendorf,5430R)，荧光倒置显微镜(OLYMPUS，1×71)，7500 Fast Real-Time PCR仪(AB，IQ5)，DYY-12型电泳仪(北京市六一仪器厂)，蛋白凝胶成像系统(GE Healthcare， Image Quant LAS4000)，超纯水机(UPH,成都超纯科技有限公司)。

1.2　方法

1.2.1SIEC和PK-15细胞的培养与TGEV的增殖

按常规方法进行细胞培养[5]，与TGEV病毒液(TCID50为103.8/0.1mL)的准备。

1.2.2试验分组及处理见(表1)

表1试验分组及处理方法

1.2.3荧光染色

参照文献3进行。

1.2.4Western blot 检测细胞凋亡主要调控因子的蛋白表达情况

将对数生长期的SIEC悬液接种于培养瓶中,当SIEC约长成80%的丰度时, PBS清洗细胞2次，接入相应药物处理或维持液2mL，24h，弃液；再接种100TCID50 TGEV病毒液或维持液1mL，37℃孵育2h,弃病毒液,加入维持液，分别感染0h、2h、4h、8h、12h、24h、48h、72h后弃细胞培养液，提取细胞总蛋白，进行Western blot分析[6]，结果见表1。

1.3　数据处理

用 SPSS20.0软件分析统计结果。

2　结果

2.1　荧光显微镜下细胞形态的变化

SIEC细胞 AO/EB染色后(如图1)：对照组只被AO染色，细胞核呈长梭形绿色荧光，胞浆内无明显颗粒，细胞核膜完整，核大，呈圆形或椭圆形，形态规则，边缘清晰，染色质均匀(图1-1)；随时间的延长感染TGEV的模型组，其细胞核内染色质固缩，细胞核发生明显碎裂和聚缩，细胞膜失去完整性。(图1-2～1-5)；中药复方参术组干预感染TGEV的SIEC结构清晰，呈长梭形，大部分细胞核结构较清晰，染色质着色均一，凋亡现象不明显，但存在少量的细胞核变大或碎裂现象(图1-10～1-13)；苦参碱组间于复方参术组与模型组之间(图 1-6～1-9)。

图1　复方参术对TGEV 感染SIEC细胞形态学的影响(200×)图1-1 正常细胞；图1-2～1-5分别为TGEV 感染12h、24h、48h、72h；图1-6～1-9为苦参碱组TGEV 感染12h、24h、48h、72h；图1-10～1-13为复方参术组TGEV 感染12h、24h、48h、72h。

2.2　复方参术干预TGEV感染SIEC的 Bcl-2和Bax蛋白表达水平的影响

图2　复方参术对感染TGEV的SIEC Bcl-2蛋白表达水平的影响

图3　复方参术对感染TGEV的SIEC Bax蛋白表达水平的影响

由图2和3可知，与感染TGEV模型组比较复方参术组和苦参碱组Bcl-2蛋白表达明显上调。复方参术组和苦参碱组Bax蛋白表达量在TGEV感染细胞4h后开始下调，对照组与感染TGEV模型组的Bax一直保持高效表达 。

2.3　复方参术对感染TGEV的SIEC细胞Bcl-2和Bax mRNA水平的影响

图4表明，Bcl-2mRNA转录水平随着TGEV感染细胞时间的延长，TGEV逐渐下降，与对照组相比差异显著(P<0.05)，复方参术组极显著(P<0.01)；与空白组相比，8h时模型组 Bcl-2 mRNA转录量减少(P<0.01)，复方参术组显著增加(P<0.05)；12h时模型组Bcl-2 mRNA转录量减少，复方参术组显著增加(P<0.01)，苦参碱组表达量增加；24h时复方参术组极显著增加(P<0.01)；48h时复方参术组极显著增加(P<0.01)，苦参碱组表达量增加；72h时复方参术组显著增加(P<0.05)，苦参碱组极显著增加(P<0.01)。这与Bcl-2蛋白表达水平检测结果一致。

由图5可知，随着TGEV感染SIEC时间的延长，TGEV组Bax mRNA转录一直保持较高水平。复方参术Bax mRNA转录量随着时间的延长表达量一直较低，与对照组和TGEV相比差异极显著(P < 0.01)。Bax mRNA变化趋势与蛋白表达水平一致。

3　讨论

TGEV属于冠状病毒科(Coronaviridae)、α冠状病毒属(Coronavirus)，与PEDV有较高的同源性。一旦发病，可致使仔猪大量死亡。目前对该病的防治主要有疫苗、化药及外源性细胞因子等。由于病毒基因突变快、血清型多，为疫苗的研发与应用带来众多困难；中药抗病毒基于“祛邪”与“扶正”的理论。在于中药可以直接杀死病毒、抑制病毒复制，而且可以提高机体免疫力，增强抗病毒功效。

图4　复方参术对感染TGEV的SIEC细胞Bcl-2 mRNA水平变化，*(P<0.05)，**(P<0.01)

图5　复方参术对感染TGEV的SIEC细胞Bax mRNA水平变化，*(P<0.05)，**(P<0.01)

根据TGEV感染仔猪后的特征性症状，本实验通过加减化裁经典方剂“参苓白术散”，开展中药复方对猪传染性胃肠炎病毒的治疗研究。

TGEV病毒通过S麦穗蛋白与宿主细胞N-pAPN结合，介导TGEV与SIEC细胞膜融合，最终引发病毒侵入细胞内部并在该细胞内进行复制，产生大量的具有感染毒性的病毒粒子[3][7][8]。TGEV能够引起细胞病变致使细胞凋亡。细胞凋亡主要有两条通路，一条为死亡受体通路，主要包括Fas和TNF等肿瘤坏死因子受体超家族；另一条为线粒体通路，线粒体处于细胞凋亡信号转导的中心地位，其相关的基因家族主要是Bcl-2家族。其中Bcl-2和Bax是调控细胞凋亡发生的两个关键因子，通过控制Cyt-C的释放和下游Caspase-3蛋白酶的活化，介导细胞凋亡，Bax表达增加或Bcl-2表达下调均可诱导细胞凋亡[9，10，11]。本实验结果表明，SIEC感染TGEV后细胞出现CPE现象，细胞发生凋亡，同时Bax表达增加，Bcl-2表达减少，而通过复方参术干预TGEV感染SIEC后这一现象得到改善，致使细胞凋亡现象不再明显。

4　结论

试验结果表明，复方参术汤可显著增加Bcl-2的表达量，减少Bax的表达量，从而抑制TGEV诱导SIEC的凋亡，实现对SIEC的保护。

参考文献：

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[2]Jeong H P, Jeong H H, Hyuk M K. Sequence analysis of the ORF 7region of transmissible gastroenteritis viruses isolated in Korea. VirusGenes, 2008(36):71-78.

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[4]卫文强,吴润,刘磊.4味中草药的体外抗TGEV试验.西北农林科技大学学报(自然科版),2015(12):23-28.

[5]王静.永生化猪小肠上皮细胞系的建立及猪轮状病毒对其影响的研究[D].杨凌：西北农林科技大学,2014.

[6] Ding L, Xu X, Huang Y, Li Z, Zhang K, Chen G, Yu G, Wang Z, Li W, Tong D.Transmissible gastroenteritis virus infection induces apoptosis through FasL-andmitochondria-mediated pathways.Veterinary microbiology, 2012(158):12-22.

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[12] 王雪飞.中药复方体外抗TGEV诱导猪小肠黏膜上皮细胞凋亡的机制研究[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2016.