共轭亚油酸合成原料的研究进展

张　可　滕域晰　胡　凯　陶永胜　王　华　靳国杰,2,3

(西北农林科技大学葡萄酒学院1，杨凌　712100) (陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心2，杨凌　712100) (西北农林科技大学合阳葡萄试验示范站3，合阳　715300) (西北农林科技大学创新实验学院4，杨凌　712100)

20世纪70年代末，美国威斯康辛大学的Pariza及其同事[1]研究煎炸汉堡中的致癌物质时，偶然发现一种无论烹饪与否都一直存在的物质具有抑制肿瘤细胞生长的作用。后来这种抑癌物质被确定为共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid, CLA)[2]。CLA是共轭双键位于不同位置的十八碳二烯酸位置异构体和几何异构体的统称，是亚油酸(Linoleic acid, LA)的同分异构体[3-4]。理论上，CLA共有56种异构体，即14个共轭双键位于碳2和碳4至碳15和碳17的位置异构体，每个位置异构体具有cis,cis、trans,trans、cis,trans和trans,cis4种构象。现在经13C NMR鉴定存在的有20种[5]。大量的实验表明，与人类和动物营养最为相关、最具有生理活性的两种异构体是c9,t11-CLA、t10,c12-CLA，其具有抗肿瘤、促进骨骼健康、增强机体免疫力、抗动脉粥样硬化、减少体内脂肪蓄积、抗氧化、延缓机体衰老、防治糖尿病、增加肌肉等功效。随着研究的深入，发现t9,t11-CLA对人类身体健康也有促进作用。CLA是人类近年来发现的最重要的功能性脂肪酸，由于其众多的作用，引起了国际医学界、营养学界的广泛关注。

图1　亚油酸及3种共轭亚油酸异构体的结构式

天然来源的CLA主要存在于反刍动物的奶和肉制品中。乳制品中CLA的含量为2.9～8.2 mg/g，肉制品中CLA的含量为0.3～5.6 mg/g[6]。研究表明，一位成年人每日摄入量要达到3.0 g以上时，CLA才能发挥其生理功能[7-8]。调查显示，大量摄入奶和肉制品的欧美人每人每日CLA摄入量低于1.0 g，尚达不到CLA的摄入标准[9]。我国由于膳食结构以淀粉类食物为主，肉制品和乳制品摄入量较少，更加需要提高CLA的摄入量[10]。但是天然来源的CLA有限，因此人工合成CLA成为了人们获取CLA的主要途径。原料的选择和利用影响了CLA合成反应的效率和生产成本。本文系统介绍了游离脂肪酸、烷烃酯、甘油酯等不同形式的LA及天然油脂在CLA生产中的运用，并综述了食品发酵中CLA的生产，为优化CLA原料利用、经济高效地获取CLA提供了参考。

1　原料的不同形式

人工合成CLA主要以不同形式的LA为原料，采用化学合成法、光催化异构法、微生物合成法等，通过异构化或水合-脱水异构化反应合成CLA。LA的形式包括游离脂肪酸、甘油酯、烷烃酯等。游离脂肪酸LA即LA的游离形式，甘油酯LA包括亚油酸甘油三酯、亚油酸甘油二酯、亚油酸甘油单酯，是植物油的主要成分，常常以混合物的形式存在。烷烃酯LA包括亚油酸甲酯(Methyl Linoleate，ML)、亚油酸乙酯(Ethyl Linoleate，EL)等，主要通过人工合成获得。对于不同形式的LA原料，CLA的合成反应效率不同(见表1)。

表1　不同形式原料合成CLA

1.1　游离脂肪酸

以游离脂肪酸形式的LA为原料合成CLA，多使用化学合成法和微生物合成法。化学合成法主要包括碱催化异构法、金属催化异构法等。碱催化异构法反应过程简单，所需设备少，是工业上最常用的一种制备CLA的方法。催化剂主要有NaOH、KOH、KOCH3、KOC(CH3)3等。1950年Schmidt等用NaOH作催化剂，乙二醇为溶剂，在200 ℃下将游离脂肪酸形式的LA异构化为CLA。Wang等[11]以LA为原料、氢氧化钾为催化剂、乙二醇为溶剂(亚油酸:氢氧化钾:乙二醇=1.0:0.4:5.2 (w/w/w))，188.3 ℃下，反应4.4 h，CLA产率达到89.7%。但是，化学合成法得到的产物是一系列具有位置异构和几何异构的CLA混合物，对具有生理活性的CLA合成没有选择性，由于环化等副反应的存在，生成的产物组成复杂，不利于目的产物的分离纯化，且后期处理易造成环境污染。

为了提高活性异构体的含量，避免环境污染，研究人员探索应用微生物法合成CLA。目前各种高产CLA的菌株已有众多研究报道，大致分为三类：瘤胃菌、丙酸菌和乳酸菌。微生物合成法主要利用生长期细胞、静息细胞、亚油酸异构酶催化LA转化生成CLA。与其他方法相比，微生物法具有产物特异性强、条件温和、活性异构体含量高、无毒副作用等优点，因此受到越来越多的关注。Jiang等[23]研究发现Propionibacteriumfreudenreichiissp. sheramnii可以转化游离脂肪酸形式的LA合成CLA。Raino等[24]利用P.freudenreichiissp. shermanii JS合成CLA。将LA先溶解在聚氧乙烯型表面活性剂中，pH控制在6.3±0.2，然后进行转化，获得80.0%～87.0%的CLA转化率，且c9,t11-CLA含量高达85.0%～95.0%。许庆炎等[25]筛选了一株植物乳杆菌LactobacillusplantarumZS 2058，以磷酸钾缓冲液为转化介质，在LA质量浓度为0.8 mg/mL、细胞浓度为4.0×1010CFU/mL、37 ℃ 、pH 6.5的条件下，转化24 h，c9,t11-CLA含量达到是374.0 μg/mL，CLA总量为491.0 μg/mL，转化率可达到60.5%。游离脂肪酸形式的LA对菌株的生长具有抑制作用，尤其是对低浓度的G+菌抑制作用明显，严重影响CLA的产量[26]。

随着研究的深入，发现静息细胞能够避免LA对细胞生长的抑制，从而使反应底物的浓度得到提高，CLA的产量也相应得到了提升。2001年Raino等[27]将P.freudenreichii在添加乳清的培养基中培养后，洗涤并收集细胞，放入含有4.0 mg/mL亚油酸的磷酸盐缓冲液中进行静息细胞转化，发现转化率达到46.0%。提高细胞膜的通透性，可以提高细胞对游离脂肪酸LA的转化效率。Zhao等[28]利用冻融法对植物乳杆菌L.plantarumA6-1F进行透性化处理，然后进行CLA转化。在以磷酸盐缓冲溶液为转化介质，pH 7.0、细胞浓度为0.15 g/mL、亚油酸浓度为1.5 mg/mL、37 ℃ 的条件下转化2 h，CLA最高产量达到275.7 μg/mL，与不进行透性化处理的实验组相比，产量提高了近20.0%，且主要异构体是c9,t11-CLA。Wei等[14]用2%(w/v)十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethyl ammonium bromide, CTAB)在37 ℃下处理嗜酸乳杆菌L.acidophilus1.184细胞40 min，获得活性最高的透性化细胞。通过对转化过程参数的考察，发现在0.1 mol/L pH 4.0磷酸-柠檬酸缓冲溶液中，分别加入8.0×1010CFU/mL的透性化细胞、2 mg/mL自由LA，45 ℃下反应6 h，转速为120 r/min，CLA的转化率达到最高，为86.4%。此透性化细胞可重复利用10个循环，而且转化率没有明显降低。近几年利用微生物静息细胞转化生成CLA为众多研究者所关注，这是由于微生物细胞转化技术操作简单，在反应体系液中干扰物质少，不易染菌，更有利于下游的纯化和检测等优点，但寻找更为廉价的转化底物是当前重要的研究方向。

由于酵母、霉菌等真核微生物对游离脂肪酸LA具有较高的耐受性，近些年来研究人员采用基因工程手段，将细菌中的亚油酸异构酶基因导入到真核基因工程菌，以期获得较高的CLA转化率。He等[29]将来源于疮疱丙酸杆菌P.acnes的亚油酸异构酶(PAI)基因与基因egfp相连，整合到载体PYD1上，然后导入酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeEBY100中。经转化反应，发现了t10,c12-CLA的生成。通过优化pai基因密码子和反应条件，t10,c12-CLA最高产量达到25.4 μg/mL，此时反应条件为37 ℃、4 mg/mL游离LA、pH 7.0，反应时间为20 h。Zhang等[13]利用整合了PAI基因的解脂耶氏酵母YarrowialipolyticaPolg的静息细胞作为全细胞催化剂，经反复冻融的透性化处理后，在28 ℃、0.1 mol/L磷酸盐缓冲液体系(pH 7.0)、200 r/min转速条件下，以游离LA为底物，反应40 h，t10,c12-CLA产量达到了15.6 mg/mL，转化率为62.2%。此透性化细胞可重复使用3次，细胞活性较大。真核生产菌的使用，降低了游离LA对细胞毒害作用，提高了CLA的产量和转化率。但是，这些基因工程菌的安全性还有待于进一步验证。

尽管微生物法合成CLA的研究已有20多年，但投入商业化生产仍面临重大挑战。主要的问题是提取和纯化处理困难，且反应过程中会生成不需要的反式亚油酸和反式油酸[26]。

1.2　甘油酯

以LA甘油酯为底物生产CLA，多使用金属异构化、光异构化等化学合成法。金属催化异构法以过渡金属作为非均相催化剂或以其过渡金属的有机配合物或羰基化合物为均相催化剂来催化含有亚油酸的植物油异构化制备共轭亚油酸。催化剂包括均相金属催化剂：Cr(CO)6、RhCl3、RhCl(PPh3)3、[(C6H5)3P]2Rh(CO)Cl、[RhCl(C8H14)2]2、Ru(η6-naphthalene)(η4-cycloocta-1,5-diene)、PtCl2(PPh3)2、cis-Cl2[(C6H5)3P]2Pt、 RuHCl(CO)(PPh3)3、RuCl3.xH2O、Ru3(CO)12等。非均相金属催化剂：Ru/C、Au/C、Ru/Al2O3、Ru/HY、Ag/SiO2、Au/TS-1 、Ru/Cs-USY等。Chorfa等[30]以LA甘油酯(来源于红花油)为原料、Rh/Al SBA-15为催化剂，180 ℃下，反应5 h，CLA含量达到了70.0 mg/g油，其中，c9,t11-CLA的含量为17.0 mg/g油，t10,c12-CLA为15.0 mg/g油，t,t-CLAs为23.0 mg/g油。Van Aelst等[31]以LA甘油酯为原料、Ru/Cs-USY-0.02为催化剂，在无氢且无溶剂的情况下，180 ℃下，反应2 h，CLA的产量达到了105.0 mg/g油，产率为328.0 gCLA/gmetal/h。金属异构化对CLA的选择性低，容易发生氢化反应，使得亚油酸变为油酸或硬脂酸，催化剂寿命较短，但是反应时间较长。此外，过渡金属价格昂贵，需将其转化为相应的配合物，经济性较差而且毒性较大。

光催化法是以碘为感光剂在一定光波辐射下使LA发生异构化反应。Yettella等[21]以LA甘油酯(来自于大豆油)为原料、I2为催化剂，CLA产量达到20.0%。Shah等[22]以LA甘油三酯为原料、以0.35%的I2进行光异构化，反应140 min，CLA的产率为55.0%。光异构化合成CLA主要受反应介质与灯的距离、搅拌速度和碘的含量影响。此外，LA的纯度也能影响光异构化合成CLA。Jain等[32]在大豆油光异构化过程中发现，提纯的精制油CLA产量是粗油的80倍；且油中过氧化物、磷脂和高含量的生育酚会降低CLA的产量。在Proctor[33]实验室中，通过特制的光化学反应系统，无溶剂情况下对LA甘油酯进行光异构化，CLA的产量得到很大的提升。100 W水银灯下照射144 h，用0.15% 碘催化，CLA产率为24.0% ，对健康有益处的反式异构体占总量的17.5%，c9,t11-CLA和t10,c12-CLA约占总量的3.5%。光催化法对设备要求苛刻，感光剂与反应产物分离困难，反应时间太长，且转化率较低，目前相关研究只停留在实验室阶段。

1.3　烷烃酯

以LA烷烃酯合成CLA，常常使用化学合成法和光催化法。室温下游离的共轭亚油酸很不稳定，容易被氧化，而其烷烃酯或甘油酯形式比游离脂肪酸形式稳定。O. Berdeaux等[15]以纯度为97.3%的LA甲酯为原料，乙二醇为溶剂，氢氧化钾为催化剂，在180 ℃和氮气保护下，反应13 h，CLA的产率为97.2%，生产强度为0.6 g/L/min。马琳等[34]以LA甲酯为原料，氢氧化钠为催化剂、乙二醇为溶剂[亚油酸∶氢氧化钠∶乙二醇=1.0∶5.0∶8.4 (w/w/w)]，170 ℃下反应4 h，LA甲酯转化率和共轭亚油酸产率分别为92.4%和89.3%。Larock等[20]报道在60 ℃乙醇中存在0.8 mol%的SnCl2·2H2O和0.4 mol%的(p-CH3C6H4)3P的条件下，用0.1 mol%[RhCl(C8H14)2]2异构化LA甲酯，可获得97.0%的转化率。Andjelkovic等[35]以LA甲酯为原料、乙二醇为溶剂、以0.1 mol% [RhCl(C8H8)2]2/0.4 mol% (p-CH3C6H5)3/SnCl2·2H2O为催化剂，在60 ℃下反应24 h，CLA产率为83.0%，生产强度1.2 g/L/min。Philippaerts等[36]以LA甲酯为原料、正癸烷为溶剂、Ru/Cs-USY为催化剂，在165 ℃下，反应2 h，CLA的产率为67.0%，生产强度为0.7 g/L/min。1989年，Seki等[37]首次报道了室温下，100 W高压汞灯照射、碘为催化剂，多不饱和脂肪酸的光异构化。以石油醚为溶剂，碘量为0.1%，LA甲酯的含量为10%，汞灯下照射1.5 h，将LA甲酯转化为共轭二烯酸酯，产率约为80.0%。产物中c9,t11-CLA和t10,c12-CLA的含量相同，此外还有少量的反式十八碳烯酸甲酯和聚合物。虽然以LA烷烃酯为原料，可获得较稳定的产物，但是烷烃酯不是LA天然存在形式，需要通过甘油酯转酯化或游离脂肪酸酯化获得，操作过程繁琐，成本较高。

2　天然油脂

天然的LA通常以甘油酯的形式与其他种类的脂肪酸共存于植物种子中。由于LA与其他脂肪酸很难分离，利用高纯度的LA合成CLA成本很高。一些植物种子的油脂中LA含量很高，利用此植物油合成CLA，不仅能降低LA的纯化成本，还可以使植物油中的多酚、维生素等功能性成分进入到目的产品，增加其附加值。因此，近年来直接利用富含LA的天然油脂制备CLA越来越受到关注。为了得到CLA含量较高的产物，通常要求原料亚油酸组分达50.0%以上。用于生产CLA的天然油脂主要有红花籽油、大豆油、葵花籽油、苜蓿油、棉籽油等。很多地方根据自身地域特色，开发不同的油脂作物来合成CLA，如以碱蓬、滨蒿等天然盐生植物种子的油脂为原料，取得了较好效果。天然油脂合成CLA的方法有化学合成法、光催化法、微生物合成法等。

2.1　红花籽油

红花(Carthamustinctorius L.)是重要的药用植物，其种子含油量为25.0%～37.0%，不饱和脂肪酸比例高[38]。其中，LA含量为55.1%～77.0%，有的可高达82.0%[39]。因此，红花油是生产共轭亚油酸的理想原料。红花籽油在110 ℃发生碱性异构化反应时，LA转化率为26.5%，在130 ℃时为78.2%，当加热至170 ℃时，转化率高达99.1%[40]。Philippaerts等[36]以红花油为原料、Ru/Cs-USY为催化剂，在180 ℃下反应2 h，CLA的产率为105.0 mg/g油，反应24 h后，产量达到199.0 mg/g油，生产强度最高达到375.0 gCLA/gmetal/h。Chorfa等[41]以红花油为原料、S-Rh/SBA-15为催化剂，CLA的最高产率为110.0 mg/g油。Luis等[42]使用UV筛选法和HPLC技术筛选出22种可以合成CLA的益生菌。以红花油为原料，CLA的产量达到40.0～50.0 mg/L，其中c9,t11-CLA含量为60.0%～65.0%，t10,c12-CLA的含量为30.0%～32.0%。虽然红花种植范围广，但是产量不高，且药用红花与油用红花存在竞争。因此，用于生产CLA的红花籽油有限。

2.2　大豆油

大豆是世界上重要的油料种子之一，含油量为18.0%～22.0%。大豆油中亚油酸的含量为49.0%～53.0%[43]。由于红花籽油的短缺和高昂的价格，人们研究利用大豆油生产CLA。Ju等[44]以大豆油为原料、N-545(Ni)+S为催化剂，在220 ℃条件下反应10 min，CLA的产量为71.0 mg/g油，生产强度为277.3 gCLA/gmetal/h。Jain等[32]以1 L大豆油为原料，0.15wt%的I2为催化剂、水银灯下照射144 h，CLA的总产量为240.0 mg/g油。其中，t,t-CLA是主要的产物达175.0 mg/g油，还有35.0 mg/g油的c9,t11-CLA和t10,c12-CLA。以大豆油为生产原料，大大降低了CLA的生产成本，但相对于红花油，大豆油中亚油酸含量较低，产物中CLA含量较低。

2.3　葡萄籽油

葡萄籽是葡萄酒、葡萄果汁饮料产业的资源性副产物，含油率为6.0%～20.0%[45]。葡萄籽油含有大量的不饱和脂肪酸、维生素E、酚类化合物、植物甾醇等。其中，LA占总脂肪酸的66.8%～75.4%[46-47]，高于一般的植物油，可用于生产高品质的CLA。作者[48]所在研究团队以葡萄籽油的水解物(亚油酸含量为65.0%)为底物，分别利用酒酒球菌OenococcusoeniSD-2a的生长期细胞和静息细胞合成CLA，转化率最高为5.9%。葡萄籽油中多酚等非亚油酸组分对转化过程具有较强的抑制作用，其抑制机理和规律还需进一步研究。

3　食品发酵

CLA的利用方式有两种：一种是以不同形式的LA或天然油脂为原料合成CLA，分离纯化后添加到食品或保健品中；另一种是直接利用食物本身含有的LA或者向食物中添加足量的LA，通过动物转化或微生物发酵的方法转化生成CLA，获得富含CLA的食品。由于后一种方式操作简单，且在获取CLA的同时可以赋予食物其他有益品质，因此受到人们的欢迎。

目前，国内外科学工作者通过营养调控手段，提高了CLA在乳脂中的含量。Castro等[49]在母羊日粮中分别添加12 g/kg的葵花籽油和氢化棕榈油，羊奶中c9,t11-CLA含量分别增加29.0%和15.0%。French等[50]证明了牛背最长肌中CLA含量与采食青草量一致，放牧的牛肉中检测到的CLA含量高达10.8 mg/g，而直接饲喂饲料的牛肉中只有3.7 mg/g。一些植物油和油籽对增加反刍动物中的CLA含量产生积极影响，如向日葵的种子和油提高了牛肉和羊肉中的CLA含量，但亚麻籽、油菜籽和大豆对CLA含量的提高没有太大的影响[51-54]。

通过调整乳制品的发酵过程，可提高产品中CLA的含量。Xu等[55]在酸奶发酵中，添加丙酸杆菌(CLA生产菌)和水解大豆油，提高了产品中CLA的含量，但不影响其酸度、质地和风味。Kim等[56]在全脂奶中，用乳酸杆菌发酵，加入0.1 mg/mL的红花油，CLA含量达到8.0 mg/g脂肪。Van Nieuwenhove等[57]在水牛奶酪中，利用嗜热链球菌进行发酵，一天后，CLA含量达到4.4～5.9 mg/g脂肪。Yadav等[58]在一种印度酸奶中，将LactobacilluacidophilusNCDC 14和LactobacillucaseiNCDC 19混合培养，发酵过程中CLA含量从6.0 mg/mL增加到10.5 mg/mL。Akalin等[59]在酸奶中，利用益生菌LactobacilluacidophilusLA-5或者BifidobacteriumbifidumBB-12与起始培养物混合培养，提高了c9,t11-CLA的含量。Ekinci等[60]使用益生菌LactobacilluacidophilusLA-5，可使CLA浓度增加1.6倍(高达3.2 mg/g脂肪)，使用益生菌BifidobacteriumbifidumBB-12，可使CLA浓度增加1.8倍(高达3.5 mg/g脂肪)。Abd El-Salam等[61]在奶酪中补充富含LA甘油酯的芝麻油，组合添加两种益生菌Lactobacillusdelbreukiisubsp.bulgaricus和Streptococcusthermophilus进行发酵，温度为20 ℃，持续发酵60 d后，CLA含量增加至最大，为8.5 mg/g脂肪。

富含膳食纤维和多不饱和脂肪酸的坚果类食物通过CLA生产菌的发酵，可提高其CLA含量。Schlormann等[62]在模拟肠道的条件下，使用人类粪便微生物群(含CLA生产菌)发酵榛子、杏仁、澳洲坚果、开心果和核桃时，发现产物中含有较高含量的共轭亚油酸。其中，核桃仁发酵后，c9,t11-CLA、t10,c12-CLA和t9,t11-CLA的含量占总脂肪酸的3.1%，同时丁酸盐和潜在的致癌物质(如次级BA和脂质过氧化产物)含量减少。

4　展望

随着对CLA认识的不断深入以及人们对于营养健康的追求，CLA作为一种新型功能性营养强化剂，在食品、药品、保健品领域有着广阔的发展前景。但是，高浓度CLA的生产、纯化成本较高。利用生物转化和微生物发酵的方法，将含有LA的食品(如奶制品、豆制品、肉类、葡萄籽油等)转化为富含CLA的功能性食品，省去CLA的纯化工序，将成为是未来CLA利用的重要方式。葡萄籽是重要的功能性食品和保健品，其油脂中含有丰富的LA，是CLA的优良原料，同时又是其潜在的良好载体。利用葡萄籽生产CLA功能性食品具有重要的科学意义和经济价值。

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