pH值对葛仙米生理的影响

刘树文， 罗丽丽

(贵州师范学院化学与生命科学学院，贵州贵阳 550018)

葛仙米(NostocsphaeroidesKützing)学名拟球状念珠藻，生长于水稻田中，是我国传统出口的一种珍贵野生药食两用固氮蓝藻，营养价值丰富，食用历史悠久[1]。其蛋白含量较高，含有丰富的人体必需的各种氨基酸、脂肪酸、维生素以及矿质元素，并且含有具有药用价值的各种多糖、色素等，还含有超氧化物歧化酶等生理活性物质[1-2]。因此，它在保健食品、食品添加剂、动物饲料、医药、美容以及精细化加工等领域具有广阔的开发应用前景[1-2]。葛仙米在世界范围内分布稀少，主要分布在我国湖北省鹤峰县走马镇[1]，目前国内外对葛仙米的研究相对较少，对其开发利用也没有像小球藻、螺旋藻和盐藻那样已实现产业化[2]。为了合理地开发利用葛仙米这种珍稀食品，对葛仙米的人工培养条件及生理特性的研究意义重大。

一些研究表明，水体的pH值影响藻类生长和生理代谢以及藻类种群的演替，不同的藻类有不同的pH值适应范围[3-8]。pH值会影响藻类对无机碳及铁等微量元素在水体中的存在形式，进而影响藻类对无机碳和铁等微量元素的吸收利用[8]，藻类在生长过程中也会改变水体pH值[9]。水体pH值增加通常会引起蓝藻占优势[10]。薛凌展等研究表明，铜绿微囊藻适合生长的pH值为8～11，最佳pH值为9；而普通小球藻适合生长的pH值为7～9，最佳pH值为8[11]。共同培养的试验结果显示碱性环境中铜绿微囊藻的竞争优势强于普通小球藻[11]。

本研究比较了不同pH值(6.0、7.0、8.0)对葛仙米生长以及各种光合色素、可溶性糖、可溶性蛋白含量等方面的生理影响差异，并在培养液中加入pH值缓冲剂固定葛仙米生长过程中的pH值，旨在发现人工培养野生葛仙米的最适合pH值，为野生葛仙米的规模化养殖提供理论依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料

2015年4月从贵州省岑巩县开本乡沈家湾村采集得到新鲜野生葛仙米球形体。先将葛仙米球形体用无菌的蒸馏水冲洗干净，再用75%乙醇溶液浸泡30 s，去杂藻杂菌，然后用无菌BG110培养液(不含NaNO3的BG11培养基)清洗3次。再放入葛仙米群体质量1倍的BG110培养液，用玻璃匀浆器匀浆成丝状藻浆，然后用无菌BG110培养液稀释。培养温度为 25 ℃，用30 W日光灯提供光照，光照度为1 500 lux。用空气泵通入用0.22 μm滤膜过滤的无菌空气，通气量为 300 mL/min。经过15 d的培养，得到无杂菌和杂藻的野生葛仙米藻种。

1.2　培养条件

葛仙米的培养采用BG110培养基，配制BG110时加入BICINE(N,N-二羟乙基甘氨酸)生物缓冲剂，缓冲剂浓度为20 mmol/L[8]，用0.1、1.0 mol/L HCl或NaOH溶液调节BG110培养基pH值为 6.0、7.0、8.0，在121 ℃下灭菌30 min。藻种经过匀浆之后分别接种到高压灭菌后的9个500 mL锥形瓶，分别加入pH值为6.0、7.0、8.0的BG110培养基，藻液总体积为 450 mL/瓶，初始接种量按照叶绿素含量450 μg/mL。每组pH值条件设置3个重复。培养温度为25 ℃，用30 W日光灯提供光照，光照度为1 500 lx。用空气泵通入用0.22 μm滤膜过滤的无菌空气，通气量为300 mL/min，经过10 d光照培养。

1.3　生长曲线的制作和比生长速率的测定

在葛仙米的生长过程中，每隔1 d取1次藻液。培养液pH值为6.0、7.0、8.0的培养瓶中各取20 mL藻液，4 000 r/min 离心30 min，倒掉上清液，加入4 mL 95%乙醇，振荡，4 ℃冰箱中避光放置24 h。4 000 r/min离心30 min，取上清液，用分光光度计分别测定665、649 nm波长的吸光度D665 nm、D649 nm。根据以下公式计算叶绿素a(Chlorophyll a，Chla)含量(μg/mL)[12]：Chla=13.95×D665 nm-6.88×D649 nm。绘制时间(d)、叶绿素含量(μg/mL)的生长曲线图。比生长速率μ的计算依据公式μ=(lnx1-lnx2)/(T2-T1)，其中x1和x2分别为培养后0、10 d的叶绿素a含量(μg/mL)，T1、T2分别为培养后0、10 d。

1.4　各种主要光合色素含量的测定

从培养10 d的葛仙米藻液中按照“1.2”节的方法取样和提取色素，用分光光度计分别测定665、649、447 nm波长的吸光度D665 nm、D649 nm、D470 nm。计算叶绿素a与类胡萝卜素(carotenoids，Car)含量，其中Car含量的计算依据公式[12]：Car=1 000×D470 nm-2.05×Chl a。

从培养10 d的葛仙米藻液中各取20 mL的藻液，4 000 r/min 离心30 min，去上清液，各加入4 mL pH值为7.0的0.1 mol/L磷酸缓冲液，冰浴匀浆90次，4 000 r/min离心30 min。取上清液，用分光光度计分别测定上清液在562、615、652 nm波长的吸光度D562 nm、D615 nm、D652 nm。计算藻蓝蛋白(pycocyanin，PC)、别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)、藻红蛋白(phycoerythrin，PE)的含量。根据Siegelman等的公式[13]计算：PC(mg/mL)=(D615 nm-0.474×D652 nm)/5.34；APC(mg/mL)=(D652 nm-0.208×D615 nm)/5.09；PE(mg/mL)=(D562 nm-2.41×PC-0.849×APC)/9.62。

1.5　蛋白质含量的测定

从培养10 d的葛仙米藻液中各取20 mL的藻液，4 000 r/min 离心30 min，去上清液，各加入4 mL pH值为7.0的0.1 mol/L磷酸缓冲液，冰浴匀浆90次，4 000 r/min离心30 min。取上清液，用考马斯亮蓝法测定各样品中蛋白质的浓度[12]。

1.6　可溶性糖含量的测定

培养10 d的各瓶葛仙米藻液各取20 mL的藻液，4 000 r/min 离心30 min，去上清液，各加入4 mL蒸馏水，冰浴匀浆90次，4 000 r/min离心30 min。取上清液，蒽酮试剂法测定各样品中可溶性糖浓度[13]。

1.7　统计分析

本试验主要利用软件STATISTICA®7.0(StatSoft Inc，Tulsa，OK，USA)进行统计分析处理。单因素方差分析(ANOVA)和Tukey’s显著性检验(HSD)用来检测不同处理间的显著性水平。Lilliefors检验和Levene检验分别用来检验正态分布和方差同质性分析。

2　结果与分析

2.1　不同pH值条件下葛仙米的生长

研究显示，葛仙米分别在6.0、7.0，8.0 pH值条件下培养10 d后，以叶绿素浓度表示的生物量分别增加到培养后0 d的6.61、9.21、7.47倍(图1)。当pH值为7.0时，葛仙米的比生长速率显著高于其他2种不同pH值条件下葛仙米的比生长速率(Tukey’s HSD，P<0.05)，pH值为8.0时葛仙米的生长速率略高于pH值为6.0培养条件下葛仙米的比生长速率，但2者之间无显著差异(Tukey’s HSD，P>0.05) (表1)。

表1　在不同pH值葛仙米的比生长速率

注：不同的小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)。表2、表3同。

2.2　不同pH值条件下葛仙米的光合色素含量的变化

研究显示，pH值对葛仙米PC、APC、PE含量以及Chla含量、Car含量有不同影响(表2、表3)。当pH值为7.0时，葛仙米的各种光合色素的含量最高，pH值为8.0时的葛仙米各种光合色素的含量高于pH值为6.0时，且都有显著差异(Tukey’s HSD，P<0.05)。当pH值为7.0时，葛仙米的PC、APC、PE、Chla、Car的含量分别为pH值为8.0和6.0时葛仙米的光合色素含量的1.37、1.57、1.41、1.12、1.18倍和2.14、3.12、2.30、1.32、1.34倍。

表2　不同pH值条件下葛仙米的PC、APC、PE的含量

表3　不同pH值条件下葛仙米的Chla和Car含量

2.3　不同条件下葛仙米的可溶性蛋白含量的变化

研究发现，pH值对葛仙米的可溶性蛋白含量有影响。当pH值为7.0时，葛仙米的可溶性蛋白质含量显著高于pH值为8.0、6.0时葛仙米的可溶性蛋白含量，分别是pH值为 8.0、6.0时的1.3、2.0倍。当pH值为7.0时，葛仙米的可溶性蛋白含量最高，pH值为8.0时葛仙米的可溶性蛋白含量高于pH值6.0时，且都有显著差异(Tukey’s HSD，P<0.05，图2)。

2.4　不同pH值条件下可溶性糖含量的变化

研究发现，pH值对葛仙米可溶性糖含量有影响(图3)。当pH值为7.0时，葛仙米的可溶性糖含量显著高于pH值为 8.0、6.0时葛仙米的可溶性糖含量。pH值为8.0时葛仙米的可溶性糖含量略高于pH值为6.0时葛仙米的可溶性糖含量，但两者之间无显著差异(Tukey’s HSD，P>0.05)。

3　结论与讨论

本研究结果表明，当培养液中pH值为7.0时，培养10 d后以叶绿素含量表示的葛仙米生物量增长幅度和比生长速率最大，各种光合色素、可溶性糖及可溶性蛋白质含量最高，当培养液中的pH值为8.0时上述各项生理指标高于培养液pH值为6.0时的上述各项生理指标。因此，pH值为7.0的培养液比较适合贵州野生葛仙米的人工养殖。

刘继勇对湖北省走马镇的葛仙米资源及葛仙米生长的环境条件进行调查研究，结果表明，适于葛仙米生长的灌溉水源pH值为6.2～6.3[14]。但该研究并未调查葛仙米生长水体的pH值，葛仙米生长水体的pH值会受到农业生产的影响，如农业生产施肥以化肥为主的碳铵等肥料的使用会改变土壤及农田水体的酸碱度[1]。程超等在葛仙米生长及繁殖条件的探讨的研究中以葛仙米的生长曲线总结得出，葛仙米最适生长pH值为6.0～7.5，pH值过高或过低都会影响它的生长及颜色[15]。在一定范围内，随着pH值的升高，葛仙米的颜色会加深，直至pH值升至7.5，但该研究没有考虑葛仙米生长过程中pH值的变化[15]。藻类的种群密度和生理代谢活动都会影响水体的pH值，藻类生长过程中水体的pH值是不断发生变化的[9]。本研究通过pH值缓冲剂固定培养液的pH值，得到固定pH值条件下葛仙米的各项生理指标。

溶解在水体中的HCO3-、CO32-、CO2都是藻类可以直接或间接吸收利用的无机碳形式。pH值会影响到培养液中CO2溶解度以及HCO3-、CO32-、CO2三者之间的解离平衡，进而影响藻类对无机碳的吸收利用效率及光合作用速率[9]。CO2是藻类易于吸收的形式，pH值升高使水体中溶解的CO2含量降低而HCO3-含量升高。但pH值降低，水体中总无机碳含量降低[16]。铁等微量金属元素在藻类光合和呼吸等代谢过程中起重要作用，pH值还影响水体中Fe(OH)3、Fe2+、Fe3+之间的相互转化，从而影响藻类对铁的吸收利用[16]。因此，pH值为6.0时葛仙米的各项生理指标较pH值为7.0时低，可能是因为培养液中总无机碳浓度较低，影响了葛仙米的光合固碳。pH值为8.0时葛仙米的各项生理指标也较pH值为7.0时低，可能是因为pH值升高导致水体中可利用铁含量降低。

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